JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Engineered Vaskülarize Muscle Flap

Published: January 11, 2016
doi:
10.3791/52984
, , , , ,
1Department of Plastic Surgery,Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering,Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology,Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department,Technion Israel Institute of Technology

Summary

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Abstract

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

Introduction

Karın duvarı defektleri sıklıkla şiddetli travma, kanser tedavisi, yanık ve enfekte mesh çıkarılmasını takiben ortaya çıkar. Bu kusurlar genellikle komplike cerrahi girişimler gerektiren ve plastik rekonstrüksiyon cerrahlar 1-4 için büyük bir meydan okuma sunan, önemli doku kaybı içerir. Yapay dokular için yeni kaynaklar arayan Doku mühendisliği araştırmacılar farklı malzemeler, hücre kaynakları ve büyüme faktörleri incelemiş bulunuyoruz. Bu tür işlenmiş dokular implantasyonu ile trakea 5,6, mesane 7, kornea 8, kemik 9 ve cilt 10, çeşitli dokuların başarılı restorasyonu daha önce rapor edilmiştir. Ancak, kalın damarlı mühendislik dokusunun fabrikasyon özellikle büyük defektlerinin rekonstrüksiyonu için, doku mühendisliğinde önemli bir sorun olmaya devam etmektedir.

Bir canlı doku yapısının kalınlığını sınırlayan en önemli faktörlerden biri de eksilerini oksijen kaynağı kontrolünü olantituent hücreleri. Difüzyon dayanarak zaman, kalınlığı çok ince bir tabaka bu sınırlıdır oluştururlar. , Oksijen ve in vivo besin tedarik kılcal damarların arasındaki maksimum mesafe oksijen 11,12 difüzyon sınırı ile bağlantılı olan, yaklaşık 200 mm. Yetersiz vaskülarizasyon doku iskemisi neden ve doku rezorpsiyonu veya nekroz 13 kadar varabilmektedir.

Buna ek olarak, doku onarımı için kullanılan ideal malzeme, biyolojik uyumlu ve immünojenik olmayan olmalıdır. Ayrıca, biyo ev sahibi hücrelerin daha da entegrasronu ve yapısal bütünlüğünü muhafaza kapasitesine sahip olmalıdır. Çeşitli biyolojik 14-16 ve sentetik 1,17,18 matrisler önce ancak bunların kullanımı etkili kan temini, enfeksiyonlara veya yetersiz doku gücü eksikliği nedeniyle sınırlı kalmaktadır, doku rekonstrüksiyonu için araştırılmıştır.

Bu çalışmada, biyolojik olarak uyumlu, hücre embGıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı poli-L-laktik asit (PLLA) / laktik-ko-glikolik asit (PLGA), poli, oluşan gömülmüştür skafold çıplak farenin femoral arter ve ven (AV) damarların etrafında yerleştirildi ve Sadece AV Gemilerden damarlanmayı sağlanması, çevre dokuya ayrılmış. Bir hafta implantasyon sonrası, greft, canlı, kalın ve iyi vaskülarize oldu. AV damarları ile bu kalın vaskülarize doku, daha sonra aynı fare bir karın tam kat defekt pediküllü flep olarak aktarıldı. Bir hafta sonrası transferi, flep, canlı damarlı ve iyi karın iç organları desteklemek için yeterli gücü taşıyan, çevre doku ile entegre oldu. Böylece, otolog pedikül taşıyan mühendislik kalın, damarlı doku flep, tam kat karın duvarı defektleri onarmak için yeni bir yöntem sunuyor.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları Technion Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından kabul edildi. Bu işlem için, atimik çıplak farelere bağışıklık sistemince reddini önlemek için kullanılmıştır. Fare başka tür kullanıyorsanız, fareler cerrahi işlem ve siklosporin idaresi (ya da başka bir anti-ret yerine) öncesinde tavsiye edilir traş edilmelidir. 1. İskele Hazırlama ve Hücre katıştırma Aşağıdaki şekilde poli-L-laktik-asit (PLLA) ve polilaktik-ko-glikolik…

Representative Results

In vivo Greft damarlanma ve perfüzyon Greftler önce eksenel flep olarak transfer bir ya da iki hafta implante edildi. Bir ve iki hafta sonrası implantasyon anda, greft alanının brüt gözlem canlı ve vaskülarize doku greft saptandı. Pozitif CD31 immün (Şekil 1A) ile tespit ve son derece perfüze FITC-dekstran kuyruk damarından enjeksiyon ve ultrason ölçümleri ile kanıtlandığı gibi, bu greftler, oldukça yüksek oranda damarlanmış kanıtladı. Bir…

Discussion

Doku mühendisliği alanındaki ilerlemeler, çeşitli doku tiplerinin yeniden inşası için yedek dokular için büyüyen bir talep ile karşılandı. 1,17,18, sentetik ve biyolojik 14-16 malzeme olarak hem de üretim yöntemlerinin çeşitliliği, bu talepleri karşılamak için kapasiteleri açısından değerlendirilmiştir. Ancak, klinik bakım ve doku mühendisliği gelişmelere rağmen, tam kalınlıkta karın duvarı defektleri restorasyonu bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu tür kitles…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by the FP7 European Research Council Grant 281501, ENGVASC.

Materials

small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
spring scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
serrated forceps  Fine Science Tools (FST) 11050-10
needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Small vessel cauterizer  Fine Science Tools (FST) 18000-00
Duratears Alcon 5686
Sedaxylan Euravet DJ03
Clorketam 1000 Vetoquinol 4A0726B
Buprenorphine vetmarket B15100
4-0 silk sutures Assut sutures 647
6-0 polypropylene sutures Assut sutures 9351F
8-0 silk sutures Assut sutures 684568
Insulin syringe (6mm needle) BD 324911
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Micromarker non-targeted contrast agent VisualSonics inc. VS-11694
tail vein catheter VisualSonics inc. VS-11912
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran Sigma FD500S
Matlab Mathworks, MA, USA
Kimwipes Kimtech 34120
antigen unmasking solution Vector laboratories H-3300
anti-CD31 antibody Abcam  ab28364
biotinylated goat anti-rabbit (secondary) antibody Vector laboratories BA-1000
streptavidin-peroxidase Jackson  016-030-084
Mayer's hamatoxylin solution Sigma-Aldrich MHS-16
aminoethylcarbazole (AEC) substrate kit Life technologies, Invitrogen  00-2007
Vectamount Vector laboratories H-5501
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28 (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12 (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32 (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69 (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18 (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28 (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193 (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50 (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52 (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14 (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8 (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118 (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111 (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27 (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G., Luna, L. G. . Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. , (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3 (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100 (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7 (7), e40741 (2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization–the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15 (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108 (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053 (2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21 (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106 (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34 (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399 (2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).

Tags

Vascularized Muscle FlapAbdominal Wall DefectScaffoldEndothelial CellsMuscle CellsFibroblastsFemoral ArteryFemoral VeinAnastomosisPedicled FlapVascularizationUltrasoundDextranCD31Biodynamic TestDonor Site MorbidityPlastic SurgerySurgical Procedure
check_url/52984?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Egozi, D., Shandalov, Y., Freiman, A., Rosenfeld, D., Ben-Shimol, D., Levenberg, S. Engineered Vascularized Muscle Flap. J. Vis. Exp. (107), e52984, doi:10.3791/52984 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image