كوبفر عزل الخلايا للجسيمات متناهية الصغر سمية اختبار
Summary
Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.
Abstract
الغالبية العظمى من الدراسات في المختبر nanotoxicological استخدمت خطوط الخلايا خلد عن التطبيق العملي لها. ومع ذلك، فقد أظهرت النتائج من جسيمات متناهية الصغر اختبار السمية في خطوط الخلايا خلد أو الخلايا الأولية التناقضات، مما يبرز الحاجة إلى توسيع استخدام الخلايا الأولية للفحوصات في المختبر. يصف هذا البروتوكول عزلة الضامة كبد الفأر، وخلايا كوبفر اسمه، واستخدامها لدراسة سمية جسيمات متناهية الصغر. خلايا كوبفر هي السكان بلعم الأكثر وفرة في الجسم، وتشكل جزءا من الجهاز الشبكي البطاني (RES)، المسؤولة عن القبض على تعميم النانوية. ويستند كوبفر طريقة عزل الخلايا ذكرت هنا على طريقة التروية 2-خطوة تليها تنقية على التدرج الكثافة. طريقة، بناء على الهضم كولاجيناز والكثافة الطرد المركزي، ومقتبسة من البروتوكول الأصلي الذي وضعته Smedsrød وآخرون. مصممة للفئران خلايا الكبد isolatioن ويقدم عالية الغلة (ما يصل إلى 14 × 10 6 خلايا لكل الماوس) ونقاء عالية (> 95٪) من خلايا كوبفر. هذه الطريقة العزلة لا يتطلب معدات متطورة أو باهظة الثمن، وبالتالي يمثل حلا وسطا مثاليا بين التعقيد والعائد الخلية. استخدام الفئران أثقل (35-45 ز) يحسن العائد من طريقة العزل ولكن أيضا يسهل بشكل ملحوظ الإجراء من الوريد البابي إقناء؛ إدخال القنية. وقد تم قياس سمية أنابيب الكربون النانوية functionalized و -CNTs في هذا النموذج من قبل فحص LDH تعديلها. هذا الأسلوب يقيم بقاء الخلية عن طريق قياس انعدام السلامة الهيكلية للغشاء الخلية كوبفر بعد الحضانة مع -CNTs و. سمية الناجم عن -CNTs و يمكن قياسها باستمرار باستخدام هذا الاختبار، مشددا على أن خلايا كوبفر معزولة مفيدة لاختبار السمية جسيمات متناهية الصغر. الفهم الشامل للnanotoxicology يمكن أن تستفيد من هذه النماذج، مما يجعل اختيار جسيمات متناهية الصغر للترجمة السريرية أكثر ايفيcient.
Introduction
ويهدف مجال البحث nanotoxicology لوصف التأثير البيولوجي للجزيئات النانوية. لا تزال الدراسات السمية بناء على التحقيقات المجراة الطرق الأكثر دقة. ومع ذلك، فإن استخدامها محدود بسبب التكلفة والعمل والوقت متطلباتهم 1. كما تم استخدام البدائل، فحوصات في المختبر بسبب بساطتها وإمكانية تطوير الإنتاجية العالية في منصات اختبار المختبر 2 – حتى تمديد عدد من الشروط التي تم اختبارها. يتم تنفيذ معظم الدراسات nanotoxicological استخدام في فحوصات المختبر مع خطوط الخلايا خلد. ومع ذلك، هناك مخاوف بشأن استقراء هذه النتائج التجريبية لفي الجسم الحي الآثار السمية 3. في الواقع، يمكن أن خصائص خطوط الخلايا خلد تكون مختلفة كثيرا عن الأنسجة كانوا المتأتي من مثل التحول الجيني 4، وتدهور الخصائص المورفولوجية الرئيسية5، وفقدان قطبية الخلوية 6 والتعديلات الفنية مثل تنظيم وسطاء التهابات 7.
خلايا كوبفر هي السكان بلعم الأكثر وفرة في الجسم، وهي على اتصال مباشر مع الدم عن طريق المبطنة لجدار الجيوب الكبد. كجزء من الجهاز الشبكي البطاني (RES)، وهذه البلاعم هي المسؤولة عن القبض على تعميم النانوية، وبالتالي، تشكل نموذجا مناسبا للغاية لدراسة سمية جسيمات متناهية الصغر. في الجسم الحي 8 وفي المختبر وقد نشرت دراسات 9 من الاستجابات الالتهابية المرتبطة مع خلايا كوبفر تتعرض لالنانوية في مكان آخر. كما شاركت خلايا كوبفر في التسبب في أمراض الكبد مثل أمراض الكبد الكحولية 10، تليف الكبد أو التهاب الكبد الفيروسي 11 12. وأفيد أن خلايا كوبفر معزولة توفر البصيرة مفيدة لوصف الآليات الخلوية الجردolved في اضطراب الكبد 13،14.
وقد تم الإبلاغ عن عدة طرق لعزل وتنقية خلايا كوبفر. عزل الخلايا يمكن أن تنجم عن ميكانيكي أو الأنزيمية التفكك 15. يظهر الهضم كولاجيناز ميزة الحفاظ على سلامة الوظيفية للخلايا كوبفر، في حين يؤدي إلى ارتفاع كوبفر الخلايا العائد 16. مناهج تجريبية عديدة، متفاوتة في التعقيد والتكاليف، وقد استخدمت لفصل خلايا كوبفر من غيرهم من السكان خلايا الكبد. على سبيل المثال، لا يمكن أن يتحقق كوبفر نقاء الخلية immunoaffinity 17، وتدفق الكهربائي 18، التصاق الانتقائي 16 أو من خلال تقنيات الطرد المركزي 16، والذي حدد الخلايا وفقا لحجمها وكثافة. مزيج من هذه الطرق يمكن اختيار لزيادة نقاء من السكان 16. لا يوجد إجماع حول الأسلوب الأمثل لعزل الخلايا كوبفر، لأنها تعتمد في الغالب على تطبيق والمعدات المتاحةر. ومع ذلك، في حالة اختبار السمية جسيمات متناهية الصغر، وبساطة وإنتاجية عالية من التقنية المرتبطة الحفاظ الوظيفي للخلايا كوبفر يبدو أن الأكثر ملاءمة لهذا التطبيق.
ويستند كوبفر طريقة عزل الخلايا ذكرت هنا على طريقة التروية 2-خطوة تليها تنقية على التدرج الكثافة. تم تعديل طريقة من البروتوكول الأصلي الذي وضعته Smedsrød وآخرون 16 تصميم لعزل خلايا كبد الفئران. ذكرت معظم الدراسات وصفت عزل خلايا كوبفر من كبد الفئران. هنا، نحن تصف طريقة لعزل خلايا كوبفر من كبد الفأر، في ارتفاع العائد والنقاء. استخدام الفئران يقلل من تكلفة التجربة ويسمح بتجهيز عدة كبد للحصول على كميات كبيرة من خلايا كوبفر في اختبارات السمية جسيمات متناهية الصغر.
في بروتوكول التالية، وحضنت خلايا كوبفر مع أنابيب الكربون النانوية functionalized (و </م> -CNTs). الخصائص الفيزيائية والكيميائية الفريدة من الأنابيب النانوية الكربونية – أي طول ارتفاع نسبة القطر ومساحة كبيرة، جعلت الأنابيب النانوية الكربونية المرشحين للاهتمام وهي الحاملة لأغراض العلاج والتشخيص. ومع ذلك، فقد أثيرت مخاوف بشأن سمية تشارك المركز الوطني 19، وتطوير جديدة في اختبارات المختبر يهدف إلى زيادة فهم تأثير بيولوجي CNT. ويرتبط سمية في خلية كوبفر مع عدم وجود السلامة الهيكلية للغشاء الخلية. يتم قياس ذلك من خلال فقدان إنزيم LDH حشوية من الخلية إلى طاف. مبدأ هذه الطريقة، لذلك، هو إزالة أي LDH صدر وقياس ما تبقى في خلايا 20. ويتم ذلك في الأفضلية لقياس LDH صدر في طاف لأن وجود الأنابيب النانوية الكربونية في طاف يتداخل مع مقايسة 21.
نقترح استخدام هذا فعال metho كوبفر العزلة خلية بسيطة والتكلفةد لعزل عدد كبير من خلايا كوبفر وظيفية. وهذا يسمح للفحص السمية من مجموعة من الجسيمات النانوية، في نموذج بلعم الأولية ذات الصلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات التالية هي حاسمة لتحقيق عائدات عالية وقابلية عالية للخلايا كوبفر. وينبغي أن تستخدم ظروف معقمة للحد من مخاطر التلوث الجرثومي والفطري. يتعين على جميع الأدوات اللازمة لتعقيمها قبل استخدامها. الكواشف يجب الطازجة قبل تنفيذ إجراء العزل.
<p class="jove_content" style=";text-align:r…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.
Materials
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | – | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll®) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96®) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. | ||
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -. W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
