ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞の単離
Summary
Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.
Abstract
インビトロ nanotoxicological研究の大多数は、その実用性のための不死化細胞株を使用しています。しかし、不死化細胞株または初代細胞中でのナノ粒子の毒性試験からの結果は、in vitroアッセイのための一次細胞の使用を拡張する必要性を強調し、不一致を示しています。このプロトコルは、マウス肝臓マクロファージの単離、というクッパー細胞、およびナノ粒子の毒性を研究するためのそれらの使用が記載されています。クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、循環するナノ粒子の取り込みを担う細網内皮系（RES）の一部を構成します。ここで報告されたクッパー細胞の単離方法は、密度勾配上で精製し、2段階灌流法に基づいています。コラゲナーゼ消化および密度遠心分離に基づく方法は、Smedsrød らによって開発されたオリジナルのプロトコルから適合されています。ラット肝細胞のために設計さisolationおよび高い収率を提供し、クッパー細胞の高純度（> 95％）（14×10 6マウス当たりの細胞まで）。この分離方法は、洗練された、または高価な装置を必要とし、したがって、複雑さと細胞収量の間の理想的な妥協点を表していません。重いマウス（35〜45グラム）の使用は、単離方法の収率を向上させるだけでなく、非常に門脈カニュレーションの手順を容易にします。 -CNTs F官能基化カーボンナノチューブの毒性は、変性されたLDHアッセイにより、このモデルで測定しました。この方法は、F -CNTsとのインキュベーション後のクッパー細胞膜の構造的完全性の欠如を測定することによって、細胞の生存率を評価します。 F -CNTsにより誘発される毒性は、単離されたクッパー細胞は、ナノ粒子の毒性試験のために有用であることを強調し、このアッセイを使用して、一貫して測定することができます。 nanotoxicologyの全体的な理解は、臨床の翻訳よりEFFIためのナノ粒子の選択を行うこと、そのようなモデルから利益を得ることができますcient。
Introduction
nanotoxicology研究の分野は、ナノ粒子の生物学的効果を特徴づけることを目的とします。 in vivoでの調査に基づいて、毒性試験は、最も正確な方法のまま。しかし、その使用は、コスト、労力と時間の要件1によって制限されます。その試験した条件の数を拡張する-代替案としては、in vitroアッセイであるため、そのシンプルさとインビトロ試験プラットフォーム2 に高スループットの開発の可能性を使用されています。ほとんどnanotoxicological研究は、不死化細胞株を用いたin vitro アッセイを用いて実施されます。しかし、in vivoでの毒性効果3に、これらの実験結果の外挿に関する懸念があります。実際には、不死化細胞株の特性は、それらが由来した組織、 例えば、遺伝的形質転換4、鍵の形態学的特徴の劣化が著しく異なる可能性が5、携帯極性6などの炎症性メディエーター7の調節などの機能変化の損失。
クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、肝臓の類洞の壁の内側を覆うことにより、血液と直接接触しています。細網内皮系（RES）の一環として、これらのマクロファージは、ナノ粒子を循環、したがってのキャプチャを担当している、ナノ粒子の毒性を研究するために非常に適したモデルを構成している。 インビボ 8 in vitroでのナノ粒子に曝露されクッパー細胞に関連する炎症反応の9研究が他の場所で公開されています。クッパー細胞はまた、アルコール性肝疾患10、肝線維症11またはウイルス性肝炎12のような肝疾患の病因に関与しています。これは、INV、単離されたクッパー細胞は、細胞メカニズムを説明するための有用な洞察を提供することが報告されました肝臓破壊13,14にolved。
いくつかの方法は、クッパー細胞を単離し、精製することが報告されています。細胞の単離は、機械的または酵素的解離15から生じ得ます。コラゲナーゼ消化は高クッパー細胞収率16につながるながら、クッパー細胞の機能的完全性を保存することの利点を示しています。複雑さとコストが異なる多くの実験的なアプローチは、他の肝細胞集団からのクッパー細胞を分離するために使用されています。例えば、クッパー細胞の純度は、イムノ17、フロー電気泳動18、選択的接着16によって、またはそれらのサイズおよび密度に応じてセルを選択し、遠心技術16、によって達成することができます。これらの方法の組み合わせは、人口16の純度を高めるように選択することができます。それは、ほとんどのアプリケーションと利用可能なequipmenに依存するようにクッパー細胞の単離のための理想的な方法についての合意はありませんが、T。しかし、ナノ粒子の毒性試験の場合には、単純さとクッパー細胞の機能維持に関連付けられた技術の高い収率は、このアプリケーションのために最も適していると思われました。
ここで報告されたクッパー細胞の単離方法は、密度勾配上で精製し、2段階灌流法に基づいています。この方法は、Smedsrød らが開発した独自プロトコルから変更されました。16は、ラット肝細胞の単離のために設計されています。ほとんどの研究が報告され、ラットの肝臓のクッパー細胞の単離を記載しています。ここで、我々は、高い収率及び純度で、マウス肝臓のクッパー細胞を単離する方法を記載します。マウスの使用は、実験のコストを削減し、いくつかの肝臓の処理は、ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞を大量に得ることができます。
以下のプロトコルは、クッパー細胞を官能基化カーボンナノチューブ（Fと共にインキュベートしました</em>の-CNTs）。 CNTの固有の物理化学的特性-直径比と大きな表面積、即ち高い長さ、治療および診断目的のためのベクターとしてのCNTの興味深い候補を行いました。しかし、懸念は、カーボンナノチューブ19の毒性に関して提起されており、in vitro試験で 、新しいの開発は、CNTの生物学的効果の理解を高めることを目指しています。クッパー細胞における毒性は、細胞膜の構造的完全性の欠如に関連しています。これは、上清中に細胞から細胞質酵素LDHの損失によって測定されます。この方法の原理は、従って、任意の放出されたLDHを除去し、セル20に残っているものを測定することです。上清中のカーボンナノチューブの存在は、アッセイ21に干渉するので、これは上清中に放出されたLDHの測定に優先して行われます。
我々は、このシンプルでコスト効率のクッパー細胞の単離メトの使用を提案していますdは、機能クッパー細胞の数が多いを単離します。これは、関連する主要なマクロファージモデルでは、ナノ粒子の範囲の毒性のスクリーニングを可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
次の手順では、高収率とクッパー細胞の高い生存率を達成することが重要です。無菌状態は、細菌および真菌の汚染の危険性を制限するために使用されるべきです。すべての器具は、使用前に滅菌する必要があります。試薬は、新たに単離手順を実行する前に準備する必要があります。
コラゲナーゼIVの選択は、低いトリプシン活性を有する、非常に重要です。同一の供…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.
Materials
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | – | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll®) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96®) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. | ||
References
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