Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel
Summary
Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.
Abstract
The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.
Introduction
Oogheelkunde, heeft gentherapie ontpopt als de behandeling modaliteit in monogene erfelijke retinopathieën. Er zijn geërfd retinopathieën geassocieerd met genen in retinale pigment epitheel (RPE), met inbegrip van Leber congenitale amurosis 1,2, retinitis pigmentosa 3 en choroideremia 4. Het onderzoek gebied van gentherapie is uit te breiden, zowel in preklinische studies en klinische proeven met behulp van virale vectoren zoals adeno-geassocieerde virus (AAV), lentivirus (LV) en adenovirus (Ad) 5. Verschillende virale vectoren hebben verschillende tropisme in de retina. Voor een veilige en effectieve gentherapie, virale vectoren moeten zorgvuldig worden geselecteerd op basis van doelcellen en doelgenen.
De route van genoverdracht is ook belangrijk voor effectieve genoverdracht aan doelcellen dus moet zorgvuldig worden eveneens gekozen. De twee meest voorkomende methoden voor intra-oculaire aflevering van virale vectoren zijn subretrechtelijke injectie en intravitreale injectie 6. Laatstgenoemde, intravitreale injectie, is op grote schaal gebruikt om geneesmiddelafgifte te choroïdale neovascularisatie in natte leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en maculair oedeem bij diabetische retinopathie 7 behandelen. Intravitreale route verschaft blootstelling van virale vectoren voor glasvocht en binnenste retina, maar de diffusie van de vectoren naar de buitenste retina beperkt. Anderzijds, de subretinale route biedt rechtstreekse afgifte van virale vectoren aan de mogelijke ruimte tussen retina en RPE, induceren een gelokaliseerd bleb. Daarom wordt subretinale injectie momenteel beschouwd als meer efficiënte route voor het richten RPE en fotoreceptorcellen. Qua chirurgische benadering, pars plana wordt gekozen als een veilig gebied voor intravitreale injectie retinale schade bij menselijke patiënten te voorkomen. Door simpelweg het wijzigen van deze aanpak aan muizen, konden we virale vectoren subretinally of intravireally injecteren via limbale aanpak.
In deze videoartikel tonen we een eenvoudige en handige methode van subretinale injectie van virale vectoren in muizen RPE. Na enkele punctie bij posterior aan limbus met een 30 G 1/2 naald wordt een 33 G stompe naald uitgerust microliter spuit ingevoegd in de subretinale ruimte via de limbale prikplaats. De virale vectoren van 1,5-2 ul volume geïnjecteerd om de potentiële ruimte tussen retina en RPE induceren subretinale blebs. Deze werkwijze kan onder directe visualisatie worden uitgevoerd middels chirurgische microscoop. Herhaalde praktijk zal garanderen reproduceerbare resultaten, zelfs zonder directe visualisatie van de blaar formatie. Dit zal helpen de onderzoekers om nauwkeurige en tijdbesparende experimenten uit te voeren voor subretinale gentherapie bij muizen RPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze video artikel beschreven we de limbale-aanpak subretinale injectietechniek in detail met representatieve resultaten van RPE / choroïd / sclerale flat-mount. Dit is een eenvoudige en handige techniek voor subretinale injectie van virale vectoren in RPE. Directe visualisatie van bleb formatie tijdens de injectie is een belangrijke stap voor accurate levering voor de beginners. Er zijn enkele subretinale injectie technieken geïntroduceerd in Journal of Visualized Experimenten 8-10. Subretinale ruimte i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Seoul National University Research Grant (800-20140542), de Pioneer Research Program van NRF / MEST (2012-0009544), en de Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program van NRF / MEST (2009-0090895), en de verlening van NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105mm | WPI | 555583S | |
| 33G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun® injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. Intraocular delivery of recombinant virus. Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. Intravitreal injection of therapeutic agents. Retina. 29 (7), 875-912 (2009).
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B. Gene therapy for blindness. Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
