Subretinale injectie is een chirurgische techniek voor effectieve genoverdracht naar het retinale pigmentepitheel in het oog van de muis. Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor subretinale injectie van virale vectoren naar het retinale pigmentepitheel bij experimentele muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het oog is een klein en afgesloten orgaan, wat het een ideaal doelwit maakt voor gentherapie. Recentelijk zijn verschillende strategieën toegepast op gentherapie bij retinopathieën door gebruik van niet-virale en virale genoverdracht naar het netvlies en het retinale pigmentepitheel (RPE). Subretinale injectie is de beste aanpak om virale vectoren rechtstreeks aan RPE-cellen te leveren. Voordat de klinische proef van een gentherapie wordt uitgevoerd, is het onvermijdelijk om de werkzaamheid van de therapie te valideren in diermodellen van verschillende retinopathieën. Daarom wordt subretinale injectie in muizen een fundamentele techniek voor een oculaire gentherapie. In dit protocol bieden we de eenvoudige en reproduceerbare techniek voor subretinale injectie van virale vectoren bij experimentele muizen. Deze techniek is aangepast van de intravitreale injectie, een techniek die veel wordt gebruikt in oogheelkundige klinieken. De representatieve resultaten van RPE/choroid/scleral complex flat-mount zullen helpen om de werkzaamheid van deze techniek te begrijpen en het volume en de titer van virale vectoren aan te passen voor de mate van gentransductie.
Inleiding
Oogheelkunde, heeft gentherapie ontpopt als de behandeling modaliteit in monogene erfelijke retinopathieën. Er zijn geërfd retinopathieën geassocieerd met genen in retinale pigment epitheel (RPE), met inbegrip van Leber congenitale amurosis 1,2, retinitis pigmentosa 3 en choroideremia 4. Het onderzoek gebied van gentherapie is uit te breiden, zowel in preklinische studies en klinische proeven met behulp van virale vectoren zoals adeno-geassocieerde virus (AAV), lentivirus (LV) en adenovirus (Ad) 5. Verschillende virale vectoren hebben verschillende tropisme in de retina. Voor een veilige en effect....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek en de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Seoul National University Institutional Animal Care en gebruik Comite en Seoul National University Hospital Bioveiligheid Comité.
1. Voorbereiding Injection Kit en virale vectoren
- Bereid de microliter spuit uitgerust met een 33 G stompe naald gesteriliseerd met ethyleenoxide gas. Verdun de virale vectoren in PBS voor de adequate titer in de micro tube (dwz 1 x 10
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de effectiviteit van de subretinale injectie op viraal gen transductie evalueren van dit protocol, gebruikten we in de handel verkrijgbaar LV vectoren met CMV promoter die zowel GFP en RFP de indicator. Ogen werden enucleated na de juiste tijd volgens het onderzoek doel. Voor representatieve resultaten zijn ogen enucleatie 10 weken en 20 weken na de subretinale injectie. Na volledige verwijdering van de retina volgens de hierboven beschreven werkwijze, de vlakke onderstel van RPE / choroid / sclera complex werd geëva.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze video artikel beschreven we de limbale-aanpak subretinale injectietechniek in detail met representatieve resultaten van RPE / choroïd / sclerale flat-mount. Dit is een eenvoudige en handige techniek voor subretinale injectie van virale vectoren in RPE. Directe visualisatie van bleb formatie tijdens de injectie is een belangrijke stap voor accurate levering voor de beginners. Er zijn enkele subretinale injectie technieken geïntroduceerd in Journal of Visualized Experimenten 8-10. Subretinale ruimte is .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de Seoul National University Research Grant (800-20140542), de Pioneer Research Program van NRF / MEST (2012-0009544), en de Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program van NRF / MEST (2009-0090895), en de verlening van NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | Voor eenvoudige injectie met één hand |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initiële punctie voor subretinale injectie |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresceïne microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Gebruikt om vectoren te verdunnen |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Gebruikt om vectoren te verdunnen |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | Voor dilatatie | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Steriele) | Bausch&Lomb | Voor topische anesthesie | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride en zolazepam hypochloride) | Virbac | Voor algemene anesthesie | |
| Rompun injectie (Xylazine HCl) | Bayer | Voor algemene anesthesie |
Referenties
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber c....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
