الكهربية المعزولة على الاستعدادات الحبل الشوكي-جذع الدماغ من القوارض الوليد يسمح الشبكات العصبية التنفسية تسجيل الإخراج
Summary
The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.
Abstract
While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.
Introduction
التنفس هو نشاط معقد وحيوي يسيطر عليها الدماغ، مما يسمح dioxygen (O 2) امتصاص وثاني أكسيد الكربون (CO 2) القضاء. يتم إنشاء محرك التنفسي المركزي عن طريق شبكة معقدة تقع في الدماغ في كل من الثدييات 1، 2 البرمائيات والزواحف 3، 4 الطيور والأسماك 5. حتى لو كان يمكن معالجتها دراسة التنفس في الجسم الحي، والتحقيقات الآلية الدقيقة تتطلب الوصول المباشر إلى شبكة التحكم في الجهاز التنفسي. تحقيقا لهذه الغاية، وضعت أدريان وBuytendijk مستحضر ذهبية انخفاض، والتي أقطاب توضع على سجل سطح الدماغ إيقاع لدت المرتبطة الخيشومية التهوية 5. وقد تم تكييف هذا النهج في وقت لاحق من قبل Suzue في عام 1984 6 لاستخدامها في القوارض حديثي الولادة. وقد أدى ظهور هذا المستحضر إلى تقدم كبير في علم الأعصاب في الجهاز التنفسي. لأنها بسيطة نسبيا، قدمت تقنية حيحرث غير قابلة للمجموعة واسعة من التحقيقات الأساسية من السلوكيات الحركية الإيقاعية وأصولهم في القوارض حديثي الولادة.
الهدف العام من هذه الطريقة لتسجيل المتعلقات العصبية النشاط الشهيق، ودعا إيقاع مثل الجهاز التنفسي في التنفس الوهمية، التي تنتجها الشبكة في الجهاز التنفسي. هذه الطريقة يمكن أن تستخدم في مجموعة واسعة من أهداف البحث، واستهداف الردود الشهيق إلى تغيرات في الجهاز التنفسي أو الصيدلة في كل البرية نوع 7 و 8 المعدلة وراثيا الحيوانات. وبالنظر إلى أن التجارب التي تجرى عند درجة حرارة منخفضة، دون afferents الحسية، وتحت الظروف التي تركيزات الجلوكوز وO 2 في ACSF مرتفعة، وقد أثيرت تساؤلات بشأن مدى ملاءمة الفسيولوجية في الإشارات المسجلة. في حين أن هناك اختلافات واضحة بين المجراة في ظروف المختبر (على سبيل المثال، تردد رشقات نارية الشهيق) تظل الحقيقة أن وجودالعناصر الأساسية لشبكة الجهاز التنفسي 6 تجعل من الممكن لدراسة الإيقاع القوي يرتبط إلى وظيفة التماثل الساكن الحيوية 9،10.
الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذه التقنية لتسهيل الوصول المباشر إلى عناصر الدماغ للشبكة في الجهاز التنفسي، والتي هي بالكاد يمكن الوصول إليها في الجسم الحي، وخاصة في الأطفال حديثي الولادة. يتم وضع الدماغ في ظل ظروف رقابة صارمة: لا التضمين إيقاع سجلتها المدخلات وارد الطرفية من الرئتين أو الهيئات السباتي، والسماح للدراسة في التركيز على محرك الأقراص التنفسي المركزي نفسه 11. وهكذا، ويستخدم هذا الوصول إلى تطبيق مؤثرات وتسجيل إشارة خرج. وعلى النقيض من تخطيط التحجم التسجيلات، هو منظم إيقاع التنفس من قبل جميع مكوناته في جميع أنحاء الجسم (على سبيل المثال، وانتفاخ الرئة، chemosensors الطرفية)، مما يجعل من الصعب تطبيق مؤثرات دقيقة.
فيالفئران ewborn، يتكون البروتوكول من تسجيل رابع إشارة بطني الجذر على الدماغ معزولة والحبل الشوكي اقتطاع، حافظت في الاصطناعي الدماغي الشوكي السائل (ACSF). يتكون إيقاع الناتجة عن الاستعدادات الحبل الشوكي الدماغ من رشقات نارية بطيئة الفردية التي ترتبط إشارة الشهيق 9. المعزولة الاستعدادات الحبل الشوكي الدماغ وللتسجيل بسهولة في الفئران من يوم بعد الولادة 0-4 (P0 – P4) 7. يستخدم هذا الأسلوب عادة لتقييم الاستجابة ميتة الشبكة في الجهاز التنفسي، وكذلك استجابة لفرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم، والحماض أو المخدرات. ويرد بروتوكول نقص الأكسجين الحاد هنا. يتم الحصول على هذا التحفيز عن طريق سحب O 2 في ACSF. يستخدم هذا الأسلوب عادة لتقييم التسامح والقدرة على الاستجابة للإهانات ميتة. بروتوكول يؤدي الى الاكتئاب الإيقاع من الدقيقة الأولى حتى نهاية التعرض نقص الأكسجة (الشكل 1) 12. يتم عكس هذا الاكتئابخلال مرحلة ما بعد ميتة الانتعاش 12. وفيما يتعلق تصميم تجريبي، فمن المهم أن نلاحظ أن بونس، وتقع في الجزء منقاري من جذع الدماغ، لديه عمل كابح بشكل خاص على مولد إيقاع 8. وهكذا، والأعمال التحضيرية من الدماغ والحبل الشوكي الكامل منقاري عرض إيقاع أقل. يتم تحديد إدراج بونس في عينة معزولة للتسجيل وفقا لهدف التجربة 13؛ سوف دراسة تأثير جسري على شبكة النخاع المستطيل تتطلب التسجيلات مع وبدون بونس لمقارنة النتائج 14. وعلاوة على ذلك، واحدة من مزايا هذه التقنية إمكانية تمديد الجزء المنقاري لإعداد لتشمل الدماغ المتوسط و / أو مناطق دماغية بينية 15،16، مما يجعل من الممكن لتقييم أثر هذه المناطق على الشبكة الجهاز التنفسي-بونتو النخاع.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدير دقيق لنشاط الجهاز التنفسي يمكن أن يكون تحديا. في الواقع، والتنفس هو وظيفة التي يمكن أن تكون تلقائية وطوعية، وأنه هو منظم وفقا للبيئة، واحتياجات الجسم، والحالة العاطفية والسلوك. وميزة هذا الأسلوب هو عزل العناصر العصبية المسؤولة عن إنتاج الأمر التنفسي. وهكذا، و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children’s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.
Materials
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
- Feldman, J. L., Del Negro, ., A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
- Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
- Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
- Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
- Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
- Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
- Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
- Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
- Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
- Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
- Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. , 165-201 (2007).
- Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
- Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
- Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
- Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
- Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
- Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
- Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).
- Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
- Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
- Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
- Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
- Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).
- Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
- Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
- St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).
