Elektrofysiologie op Geïsoleerde hersenstam ruggenmerg voorbereidingen van pasgeboren knaagdieren Hiermee Neural Network Respiratory Output Opname
Summary
The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.
Abstract
While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.
Introduction
Ademhaling is een complex en levensactiviteit gecontroleerd door de hersenen, waardoor dizuurstof (O 2) opname en kooldioxide (CO 2) verwijdering. De centrale ademhalingsfrequentie wordt gegenereerd door een complex netwerk in de hersenstam beide zoogdieren 1, 2 amfibieën, reptielen 3, 4 vogels en vissen 5. Zelfs als de studie van de ademhaling in vivo kan worden verwerkt, nauwkeurig mechanistische onderzoeken vereisen directe toegang tot de luchtwegen besturingsnet. Hiertoe Adrian en Buytendijk ontwikkelde een verminderde preparaat goud vis, waarbij de hersenstam registratiedrager elektroden gegenereerd ritme geassocieerd met gill ventilatie 5. Deze benadering werd vervolgens Suzue aangepast 1.984 6 voor gebruik bij pasgeboren knaagdieren. De komst van deze voorbereiding heeft geleid tot een significante vooruitgang in de luchtwegen neurobiologie. Aangezien het betrekkelijk eenvoudig is de techniek voorgesteld here vatbaar is voor een breed scala aan fundamentele onderzoek van ritmische motor gedrag en hun oorsprong bij pasgeboren knaagdieren.
Het algemene doel van deze methode is het neurale correlaat van inspiratoire activiteit opnemen, respiratoire-achtig ritme genoemd fictieve ademhaling, geproduceerd door de luchtwegen netwerk. Deze methode kan worden gebruikt in een breed scala van onderzoek doelstellingen, gericht op inspiratoire reacties op de luchtwegen variaties of farmacologie zowel wild type 7 en 8 transgene dieren. Aangezien experimenten worden uitgevoerd bij een lage temperatuur, zonder sensorische afferenten en onder omstandigheden waarbij de concentratie van glucose en O2 in de aCSF hoog zijn vragen gerezen over de fysiologische relevantie van het opgenomen signaal. Hoewel er duidelijke verschillen tussen de in vivo en in vitro (bijv., De frequentie van inspiratoire bursts) blijft het een feit dat de aanwezigheid vande kernelementen van de luchtwegen netwerk 6 het mogelijk om een robuuste ritme verbonden met een vitale functie homeostatische 9,10 bestuderen.
De grondgedachte achter de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is om directe toegang tot de hersenstam elementen van de luchtwegen netwerk, die moeilijk te bereiken in vivo, in het bijzonder bij pasgeborenen vergemakkelijken. De hersenstam wordt onder strikt gecontroleerde omstandigheden geplaatst: de opgenomen ritme wordt niet gemoduleerd door perifere afferente input van de longen of de halsslagader lichamen, waardoor het onderzoek om zich te concentreren op het centrale respiratoire drive zelf 11. Daarom is deze toegang gebruikt voor stimuli toe te passen en registreer het uitgangssignaal. In tegenstelling tot opnames plethysmografie, wordt de ademritme gemoduleerd door alle componenten in het lichaam (bv., Long- distensie, perifere chemosensors), waardoor het moeilijk nauwkeurige stimuli passen.
In eenewborn rat, het protocol bestaat uit het opnemen van de vierde ventrale wortel signaal op een geïsoleerde hersenstam en een afgeknotte ruggenmerg, gehandhaafd in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF). Het ritme die door de hersenstam ruggenmerg preparaten bestaat uit afzonderlijke langzame bursts die verband houden met de inspiratiefase signaal 9. Geïsoleerde hersenstam ruggenmerg voorbereidingen zijn gemakkelijk opneembaar bij ratten van postnatale dag 0-4 (P0 – P4) 7. Deze benadering wordt gewoonlijk gebruikt om de hypoxische respons van de luchtwegen netwerk, en ook de reactie op hypercapnie, acidose of drugs evalueren. Een acute hypoxie-protocol wordt hier gepresenteerd. Deze stimulering wordt verkregen door intrekking van O2 in het aCSF; Deze benadering wordt gewoonlijk gebruikt om de tolerantie en gevoeligheid voor hypoxische beledigingen beoordelen. Het protocol induceert een ritme depressie vanaf de eerste minuut tot het einde van de blootstelling aan hypoxie (figuur 1) 12. Deze depressie wordt omgekeerdtijdens posthypoxische herstel 12. Wat betreft de experimentele opzet, is het belangrijk op te merken dat de pons, bij het rostrale deel van de hersenstam, heeft een remmende werking op de ritmegenerator 8. Zo, de voorbereidingen van de volledige hersenstam en rostrale ruggenmerg weer een lager ritme. Opname van de pons in het geïsoleerde monster voor de opname wordt bepaald afhankelijk van de doelstelling van het experiment 13; de studie van pontine invloed op de medulla oblongata netwerk zou opnames met en zonder pons vereisen de resultaten 14 vergelijken. Bovendien is een van de voordelen van deze techniek is de mogelijkheid om de rostrale deel van het preparaat mesencefalische en / of diencephalic gebieden 15,16 omvatten, waardoor het effect van deze gebieden op het ponto-medullaire respiratoire netwerk beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nauwkeurige kwantificering van respiratoire activiteit kan een uitdaging zijn. Inderdaad, de ademhaling is een functie die zowel automatisch als vrijwillig kan zijn, en dat wordt gemoduleerd volgens het milieu, de behoeften van het lichaam, de emotionele toestand en het gedrag. Het voordeel van deze techniek is het isoleren van neurale elementen bevoegd zijn de opdracht luchtwegen. Aldus elektrofysiologische opnames van de hersenstam ruggenmerg preparaten en plethysmografie complementair technieken om het gehele neurona…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children’s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.
Materials
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
- Feldman, J. L., Del Negro, ., A, C., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).
- Taylor, A. C., Kollros, J. J. Stages in the normal development of Rana pipiens larvae. Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).
- Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle. Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).
- Bouverot, P. Control of breathing in birds compared with mammals. Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).
- Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish. J Physiol. 71, 121-135 (1931).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Fournier, S., et al. Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat. J Neurosci. 33, 563-573 (2013).
- Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain. Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).
- Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation. Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).
- Onimaru, H. Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations. Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).
- Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats. Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).
- Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies. Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).
- Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation. Prog Brain Res. , 165-201 (2007).
- Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents. Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).
- Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat. Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
- Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
- Danneman, P. J., Mandrell, T. D. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. J App Physiol. 116, 47-53 (2014).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).
- Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem. J Physiol. 584, 489-508 (2007).
- Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. 5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).
- Onimaru, H., Homma, I. Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).
- Paton, J. F. Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice. J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).
- Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation. J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).
- Otsuka, H. Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat. Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).
- Gestreau, C., et al. Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity. PNAS. 107, 2325-2330 (2010).
- Caravagna, C., Soliz, J. PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command. Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).
- Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice. Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).
- Arata, A. Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro. Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).
- Onimaru, H., Homma, I. A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla. J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).
- St-John, W. M., Paton, J. F. Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation. Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).
