نموذج الأنسجة 3D الرئة الإنسان للدراسات وظيفية على<em> المتفطرة السلية</em> العدوى
Summary
Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.
Abstract
السل (TB) لا يزال يحمل خطرا كبيرا على صحة الناس في جميع أنحاء العالم، وهناك حاجة لنماذج فعالة من حيث التكلفة ولكن يمكن الاعتماد عليها لتساعدنا على فهم آليات المرض وتقدم الاكتشافات من خيارات العلاج الجديدة. في المختبر الثقافات خلية من الطبقات الوحيدة أو زملاء الثقافات تفتقر إلى ثلاثية الأبعاد (3D) والبيئة والردود الأنسجة. وهنا، نحن تصف مبتكر في نموذج المختبر من أنسجة الرئة الإنسان، والتي تبشر بالخير لتكون أداة فعالة لدراسة الأحداث المعقدة التي تحدث أثناء الإصابة بمرض السل المتفطرة (M. السل). يتكون نموذج الأنسجة 3D من الخلايا والخلايا الليفية الظهارية الأنسجة محددة، والتي يتم تربيتها في مصفوفة الكولاجين على رأس غشاء مسامي. عند التعرض للهواء، والخلايا الظهارية تطبق وتفرز المخاط في الجانب قمي. عن طريق إدخال الضامة الأولية مع M. الإنسان بالعدوى السل إلى وضع الأنسجةلتر، ونحن قد أظهرت أن الخلايا المناعية تهاجر إلى الأنسجة المصابة وتشكل المراحل المبكرة من الورم الحبيبي السل. هذه الهياكل تلخيص سمة مميزة لمرض السل البشري، الحبيبي، والذي يختلف جذريا أو لم يلاحظ عادة في استخدامها على نطاق واسع النماذج الحيوانية التجريبية. هذه الطريقة ثقافة عضوي النمط يمكن التصور 3D والتحليل الكمي القوي الذي يوفر معلومات مهمة حول الميزات المكانية والزمانية لخلايا المضيف الممرض التفاعلات. معا، ويقدم نموذجا أنسجة الرئة والأنسجة البيئة الصغرى ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للدراسات على مرض السل. وبالتالي، فإن النموذج أنسجة الرئة آثار محتملة على كل الدراسات الميكانيكية والتطبيقية الأساسية. الأهم من ذلك أن النموذج يسمح إضافة أو التلاعب من أنواع الخلايا الفردية، والتي بالتالي يوسع استخدامه لنمذجة مجموعة متنوعة من الأمراض المعدية التي تؤثر على الرئتين.
Introduction
في البشر، والاستجابات للعدوى، والتهاب الأنسجة، والتوظيف الخلوية، وإعادة عرض الأنسجة وتنظيم توازن الأنسجة هي الأحداث المعقدة التي تنطوي على أنواع مختلفة من الخلايا. وبالتالي، فإن هذه العمليات أفضل درس في بيئة النسيج المحلية. سابقا، وقد كان هذا أساسا الممكن استخدام النماذج الحيوانية التجريبية. ومع ذلك، فإن حيوانات التجارب المستخدمة على نطاق واسع عقد العديد من حدود لأنها غالبا ما تستجيب لمسببات الأمراض بطريقة مختلفة من البشر وأيضا عرض مسارا مختلفا من مرض 1. A البشرية في المختبر نموذج أنسجة الرئة يحمل إمكانيات دراسة الاستجابات المناعية محددة في رئة الإنسان.
عدوى السل البشري (TB) هو أساسا مرض يصيب الرئتين. المتفطرة السلية (M. السل)، العامل المسبب للمرض السل، تصل إلى الرئة عن طريق قطرات التي يتم نقلها إلى الفضاء السنخية، حيث اجتاحت البكتيريا عن طريق dendri الرئويةخلايا التشنج والضامة السنخية كجزء من الاستجابة المناعية الفطرية للعدوى 2،3. البلعمة من مسببات المرض يؤدي إلى تجزئة علة ضمن يبلوع ومثالي يؤدي إلى تحييد وقتل العامل الممرض من قبل بلعمية. ما يصل الى 50٪ من الأشخاص الذين تعرضوا لM. ويعتقد أن مرض السل لتكون قادرة على مسح العدوى عن طريق الاستجابة المناعية الفطرية 4. النتائج الأخرى للعدوى هي تطهير من قبل النظام المناعي التكيفي في مرحلة لاحقة، والعدوى كامنة أو في أسوأ الحالات المرض المزمن النشط 5.
في السابق لم تكن هناك نماذج الأنسجة في المختبر للدراسات السل البشري. وكثيرا ما استخدمت الثقافات وحيدة الخلية الضامة الإنسان أو خلايا الدم الطرفية الأخرى 6،7. وعيب هذا النهج هو أنها لا يمكن أن تعكس ديناميكية أنواع مختلفة من الخلايا التي تعمل معا في نسيج الرئة تتعرض لM. مرض السل </eم>. وبالتالي، هناك حاجة إلى نموذج في المختبر لتكون قادرة على إجراء دراسات الفنية والميكانيكية على السل. أنشئت في المختبر نموذج أنسجة الرئة الإنسان هو موضح هنا خلية القاعدة في الأصل من قبل مجموعتنا لإجراء دراسات عن وظائف الخلية الجذعية 8 لقد تكيفت هذه الطريقة لدراسة مرض السل.
نموذج أنسجة الرئة البشرية المقدمة هنا يتكون من خلايا والخلايا الليفية 8 الظهارية الأنسجة محددة. هذه الخلايا يتم تربيتها في مصفوفة الكولاجين على رأس غشاء مسامي في إدراج transwell وهياكل تشبه شكل العادية أنسجة الرئة الإنسان (الشكل 1). عند تعرضها للهواء تبدأ الخلايا على إفراز المخاط في الجانب قمي 8. من خلال زرع الضامة الإنسان الأساسية المصابين M. السل للنموذج، لاحظنا كيف تهاجر الخلايا المناعية في الأنسجة وتشكل المراحل الأولى من حبيبية TB 9. وهذا هو أول البشري نموذج الأنسجة described لمكافحة السل وأنه يشكل أداة واعدة لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية لمرض السل وغيرها من الأمراض في الرئة. حتى الآن، وقد استخدمنا فقط وحيدات الضامة كما الخلايا المناعية في النموذج ولكن يمكن زيادة مستوى التعقيد من خلال إدراج أنواع الخلايا الإضافية ذات الصلة.
الشكل 1. مخطط تخطيطي لنموذج أنسجة الرئة. (A) ويتكون هذا النموذج من خلايا الرئة البشرية خاصة الظهارية، M. السل -infected الضامة الابتدائية والمصنفة صبغة حمراء حيدات المسمى على الكولاجين جزءا لا يتجزأ من الخلايا الليفية التي أعدت حول مرشح transwell. التعرض للنموذج النسيج في الهواء يبدأ إنتاج البروتينات المصفوفة خارج الخلوي وإفراز المخاط والطبقية التي كتبها الظهارة. نموذج الأنسجة 3D بالتالي المتقدمة هو أداة مفيدة لدراسة M. عدوى السل في بيئة CLOيشبه كتبها sely رئة الإنسان. (B) الصور المجهرية التمثيلية للخطوات المختلفة في إعداد نموذج الأنسجة. (C) الهيكل الكامل للقسم الأنسجة نموذج الرئة. على نطاق و- 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination.
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9.
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions.
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11.
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Linköping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.
Materials
| Cell culture inserts | BD Falcon | 353092 | |
| 6-well culture plates | BD Falcon | 353046 | |
| MRC-5 cells, lung fibroblasts | ATCC#CCL-171 | ||
| 16HBE cells, lung epithelial cells | Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA | ||
| 5 x Dulbecco’s modified Eagle’s medium (5 x DMEM) | Gibco | 12800-082 | Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 µm filter. |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium with glucose (DMEM) 1x | Gibco | 41965-039 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle’s salts | Sigma | M4655 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution, 100x | Life Technologies | 11140-035 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-024 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| NaHCO3 (71.2 mg/ml) | Prepared in house | ||
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Heat inactivated for 30 min, 56 °C |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-060 | |
| Hepes buffer solution 1M | Gibco | 15630-056 | |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 7801 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA | Gibco | 15575 | |
| Bovine Collagen PA treated (500 ml) | Organogenesis | 200-055 | |
| Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml) | Advanced biomatrix | 5005-B | |
| Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg) | BD | 354008 | |
| Primary human monocytes/macrophages | Isolated from human whole blood or buffy coats. | ||
| PKH26 Red fluorescent cell linker | Sigma | MINI26 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein | M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP. | ||
| Middlebrook 7H9 medium | Difco | 271310 | |
| BBL Middlebrook ADC Enrichment | BBL | 211887 | |
| Tween-80 | |||
| Glycerol | |||
| Kanamycin B sulfate (20 µg/ml) | Sigma | B5264 | |
| Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Trypsin -EDTA | |||
| Bovine serum albumin | |||
| Paraformaldehyde | |||
| DAPI | |||
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | ||
| iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8 | Bitplane AG |
References
- Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary pathology. 49, 423-439 (2012).
- Saunders, B. M., Britton, W. J. Life and death in the granuloma: immunopathology of tuberculosis. Immunol Cell Biol. 85, 103-111 (2007).
- Kaufmann, S. H. New issues in tuberculosis. Ann Rheum Dis. Ann Rheum Dis. 63, ii50-ii56 (2004).
- Morrison, J., Pai, M., Hopewell, P. C. Tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of people with pulmonary tuberculosis in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 8, 359-368 (2008).
- Barry 3rd, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Puissegur, M. P., et al. An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells. Cell Microbiol. 6, 423-433 (2004).
- Kapoor, N., et al. Human Granuloma In Vitro Model, for TB Dormancy and Resuscitation. PLoS One. 8, e53657 (2013).
- Nguyen Hoang, ., T, A., et al. Dendritic cell functional properties in a three-dimensional tissue model of human lung mucosa. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L226-L237 (2012).
- Parasa, V. R., et al. Modeling Mycobacterium tuberculosis early granuloma formation in experimental human lung tissue. Dis Model Mech. 7, 281-288 (2014).
- Cozens, A. L., et al. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Brighenti, S., Andersson, J. Local immune responses in human tuberculosis: learning from the site of infection. J Infect Dis. 205, S316-S324 (2012).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136, 37-49 (2009).
- Gupta, U. D., Katoch, V. M. Animal models of tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 85, 277-293 (2005).
- Kashino, S. S., Napolitano, D. R., Skobe, Z., Campos-Neto, A. Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection. Microbes Infect. 10, 1469-1476 (2008).
- Singhal, A., et al. Experimental tuberculosis in the Wistar rat: a model for protective immunity and control of infection. PLoS One. 6, e18632 (2011).
- Subbian, S., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition alters gene expression and improves isoniazid-mediated clearance of Mycobacterium tuberculosis in rabbit lungs. PLoS Pathog. 7, e1002262 (2011).
- Lin, P. L., et al. Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model. Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).
- Rahman, S., et al. Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions. Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).
