पर कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक 3 डी मानव फेफड़े के ऊतकों मॉडल<em> माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em> संक्रमण
Summary
Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.
Abstract
क्षय रोग (टीबी) अभी भी दुनिया भर में लोगों के स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा मानती है, और हमें नए उपचार के विकल्प की खोजों रोग तंत्र को समझने और आगे बढ़ने में मदद करने के लिए लागत प्रभावी है लेकिन विश्वसनीय मॉडल के लिए एक की जरूरत है। Monolayers के इन विट्रो सेल संस्कृतियों या सह संस्कृतियों तीन आयामी (3 डी) पर्यावरण और ऊतक प्रतिक्रियाओं की कमी है। इस के साथ साथ, हम माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एम तपेदिक) के साथ संक्रमण के दौरान होने वाले जटिल घटनाओं के अध्ययन के लिए एक प्रभावी उपकरण हो वादा रखती है जो एक मानव फेफड़े के ऊतकों के इन विट्रो मॉडल में एक अभिनव का वर्णन है। 3 डी ऊतक मॉडल एक झरझरा झिल्ली के शीर्ष पर कोलेजन के एक मैट्रिक्स में सुसंस्कृत हैं जो ऊतक विशेष उपकला कोशिकाओं और fibroblasts के होते हैं। हवा जोखिम होने पर, उपकला कोशिकाओं विभक्त हो जाना और शिखर की ओर से बलगम स्राव करते हैं। मानव प्राथमिक मैक्रोफेज शुरू करके एम से संक्रमित ऊतक मोड के लिए तपेदिकएल, हम प्रतिरक्षा कोशिकाओं को संक्रमित ऊतक में विस्थापित और टीबी ग्रेन्युलोमा की प्रारंभिक अवस्था है कि फार्म का पता चला है। इन संरचनाओं मौलिक रूप से अलग या आमतौर पर व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक पशु मॉडल में नहीं मनाया जाता है जो मानव टीबी, ग्रेन्युलोमा, की अलग विशेषता पुनरावृत्ति। इस organotypic संस्कृति विधि मेजबान सेल रोगज़नक़ बातचीत के स्थानिक और लौकिक सुविधाओं पर निर्णायक जानकारी प्रदान करता है कि 3 डी दृश्य और मजबूत मात्रात्मक विश्लेषण में सक्षम बनाता है। साथ में ले ली, फेफड़े के ऊतकों मॉडल टीबी पर अध्ययन के लिए एक physiologically प्रासंगिक ऊतक सूक्ष्म वातावरण प्रदान करता है। इस प्रकार, फेफड़े के ऊतकों मॉडल बुनियादी यंत्रवत और एप्लाइड अध्ययन दोनों के लिए संभावित प्रभाव पड़ता है। महत्वपूर्ण बात है, मॉडल, जिससे फेफड़ों को प्रभावित करने वाले संक्रामक रोगों की एक किस्म मॉडलिंग के लिए इसके उपयोग चौड़ी, जो अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं, के अलावा या हेरफेर की अनुमति देता है।
Introduction
मनुष्यों में संक्रमण, ऊतक सूजन, सेलुलर भर्ती, ऊतक remodeling और ऊतक homeostasis के विनियमन के लिए प्रतिक्रियाओं विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से जुड़े जटिल घटनाओं रहे हैं। इसलिए, इन प्रक्रियाओं को सबसे अच्छा स्थानीय ऊतक वातावरण में अध्ययन कर रहे हैं। इससे पहले, यह मुख्य रूप से प्रयोगात्मक पशु मॉडल का उपयोग संभव हो गया है। वे अक्सर मनुष्यों की तुलना में एक अलग तरीके से रोगजनकों का जवाब और भी रोग 1 का एक अलग कोर्स प्रदर्शित हालांकि, के रूप में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रायोगिक पशुओं कई सीमाएं पकड़। इन विट्रो फेफड़े के ऊतकों मॉडल में एक मानव मानव फेफड़ों में विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए संभावनाओं रखती है।
मानव तपेदिक संक्रमण (टीबी)। माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एम तपेदिक), टीबी की प्रेरणा का एजेंट, जीवाणु फेफड़े dendri से घिरा हुआ है, जहां वायुकोशीय अंतरिक्ष में ले जाया जाता है कि एयरोसोल बूंदों के माध्यम से फेफड़ों तक पहुँचता मुख्य रूप से फेफड़ों को प्रभावित करने के लिए एक बीमारी हैटिक कोशिकाओं और संक्रमण 2,3 करने के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के हिस्से के रूप वायुकोशीय मैक्रोफेज। रोगज़नक़ के phagocytosis एक फेगोसोम भीतर बग के compartmentalization की ओर जाता है और आदर्श भक्षककोशिकीय द्वारा निराकरण और रोगज़नक़ की हत्या में यह परिणाम है। एम को उजागर व्यक्तियों के 50% तपेदिक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 4 के माध्यम से संक्रमण को खत्म करने में सक्षम माना जाता है। संक्रमण के अन्य परिणामों एक बाद में मंच, अव्यक्त संक्रमण पर या सबसे खराब मामलों पुरानी सक्रिय रोग 5 में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा मंजूरी के हैं।
इससे पहले मानव टीबी की पढ़ाई के लिए कोई इन विट्रो ऊतक मॉडल किया गया है। मानव मैक्रोफेज या अन्य परिधीय रक्त कोशिकाओं के एकल सेल संस्कृतियों अक्सर 6.7 इस्तेमाल किया गया है। इस दृष्टिकोण का नुकसान है कि वे एम के संपर्क में एक फेफड़े के ऊतकों में एक साथ काम कर रही विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की गतिशीलता को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं यक्ष्मा </eमीटर>। इस प्रकार, टीबी पर कार्यात्मक और यंत्रवत अध्ययन करने के लिए सक्षम होने के लिए इन विट्रो मॉडल के लिए एक की जरूरत है। सेल आधारित यहाँ वर्णित विट्रो मानव फेफड़े के ऊतकों मॉडल में मूल रूप से वृक्ष के समान सेल कार्यों 8 पर अध्ययन के लिए हमारे समूह द्वारा स्थापित किया गया था। हम टीबी के अध्ययन के लिए इस विधि ढाल लिया है।
यहाँ प्रस्तुत मानव फेफड़े के ऊतकों मॉडल ऊतक विशेष उपकला कोशिकाओं और fibroblasts 8 के होते हैं। इन कोशिकाओं को एक transwell डालने और सामान्य मानव फेफड़े के ऊतकों (चित्रा 1) दिखने के रूप ढांचे में एक झरझरा झिल्ली के शीर्ष पर कोलेजन के एक मैट्रिक्स में सुसंस्कृत हैं। जब हवा के संपर्क कोशिकाओं शिखर की ओर 8 पर बलगम स्रावित करने के लिए शुरू करते हैं। मानव प्राथमिक मैक्रोफेज दाखिल द्वारा एम से संक्रमित प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ऊतकों में विस्थापित और टीबी कणिकागुल्मों 9 के प्रारंभिक दौर फार्म कैसे मॉडल को तपेदिक, हम मनाया गया है। यह पहला मानव ऊतक मॉडल Descr हैटीबी के लिए ibed और यह टीबी और फेफड़ों की अन्य बीमारियों के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए एक आशाजनक उपकरण बन गया है। तिथि करने के लिए, हम मॉडल में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में केवल monocytes और मैक्रोफेज का इस्तेमाल किया है, लेकिन जटिलता के स्तर अतिरिक्त प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं के शामिल किए जाने से बढ़ाया जा सकता है।
फेफड़े के ऊतकों मॉडल के 1. योजनाबद्ध रूपरेखा चित्रा। (ए) मॉडल एम, मानव फेफड़ों-विशिष्ट उपकला कोशिकाओं से बना है तपेदिक प्राथमिक मैक्रोफेज -infected और लाल रंग लेबल monocytes एक transwell फिल्टर पर तैयार कोलेजन एम्बेडेड fibroblasts पर वरीयता प्राप्त। हवा के लिए ऊतक मॉडल का एक्सपोजर उपकला से अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन के उत्पादन, बलगम स्राव और स्तरीकरण शुरू की। इस प्रकार विकसित 3 डी ऊतक मॉडल एम अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है clo कि एक वातावरण में तपेदिक संक्रमणSely एक मानव फेफड़े। (बी) के ऊतक मॉडल की तैयारी में विभिन्न चरणों के प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियों। (सी) फेफड़ों मॉडल ऊतक अनुभाग की पूरी संरचना जैसा दिखता है। स्केल -। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination.
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9.
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions.
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11.
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Linköping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.
Materials
| Cell culture inserts | BD Falcon | 353092 | |
| 6-well culture plates | BD Falcon | 353046 | |
| MRC-5 cells, lung fibroblasts | ATCC#CCL-171 | ||
| 16HBE cells, lung epithelial cells | Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA | ||
| 5 x Dulbecco’s modified Eagle’s medium (5 x DMEM) | Gibco | 12800-082 | Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 µm filter. |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium with glucose (DMEM) 1x | Gibco | 41965-039 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle’s salts | Sigma | M4655 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution, 100x | Life Technologies | 11140-035 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-024 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| NaHCO3 (71.2 mg/ml) | Prepared in house | ||
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Heat inactivated for 30 min, 56 °C |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-060 | |
| Hepes buffer solution 1M | Gibco | 15630-056 | |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 7801 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA | Gibco | 15575 | |
| Bovine Collagen PA treated (500 ml) | Organogenesis | 200-055 | |
| Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml) | Advanced biomatrix | 5005-B | |
| Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg) | BD | 354008 | |
| Primary human monocytes/macrophages | Isolated from human whole blood or buffy coats. | ||
| PKH26 Red fluorescent cell linker | Sigma | MINI26 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein | M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP. | ||
| Middlebrook 7H9 medium | Difco | 271310 | |
| BBL Middlebrook ADC Enrichment | BBL | 211887 | |
| Tween-80 | |||
| Glycerol | |||
| Kanamycin B sulfate (20 µg/ml) | Sigma | B5264 | |
| Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Trypsin -EDTA | |||
| Bovine serum albumin | |||
| Paraformaldehyde | |||
| DAPI | |||
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | ||
| iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8 | Bitplane AG |
References
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