Analyse af<em> Yersinia enterocolitica</em> Effector Translokation i værtsceller Brug Beta-lactamase Effector Fusions
Summary
Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Abstract
Mange gramnegative bakterier, herunder patogene Yersinia spp. Beskæftiger type III sekretionssystemer til at translokere effektorproteiner i eukaryote målceller. Inde i værtscellen effektor proteiner manipulere cellulære funktioner til gavn for bakterierne. For bedre at forstå kontrollen af type III sekretion under værtscelle interaktion, følsomme og nøjagtige analyser til måling af translokation er påkrævet. Vi her beskriver anvendelsen af et assay baseret på fusionen af et Yersinia enterocolitica effektor proteinfragment (Yersinia ydre protein; YopE). Ved hjælp af TEM-1-beta-lactamase til kvantitativ analyse af translokation Assayet bygger på spaltning af et celleindtrængende FRET-farvestof (CCF4 / AM) ved omplantet beta-lactamase fusion. Efter spaltning af cephalosporin kerne CCF4 af beta-lactamase, FRET fra cumarin til fluorescein er afbrudt, og excitation af cumarin delen fører til blå fluorescensemission.Forskellige anvendelser af denne fremgangsmåde er blevet beskrevet i litteraturen synliggøre dens alsidighed. Fremgangsmåden giver mulighed for analyse af translokation in vitro og også in vivo, fx i en musemodel. Påvisning af fluorescenssignalerne kan udføres under anvendelse pladeaflæsere, FACS-analyse eller fluorescensmikroskopi. I setup beskrives her, in vitro translokation af effektorceller fusioner ind i HeLa-celler ved forskellige Yersinia mutanter overvåges ved laser scanning mikroskopi. Optagelse intracellulær omdannelse af FRET af reporteren beta-lactamase effektor fusion i realtid giver robust kvantitative resultater. Vi viser her eksempler på data, der viser øget translokation af et Y. enterocolitica YopE mutant sammenlignet med vildtypestammen.
Introduction
Type III sekretion systemer er specialiserede protein-eksport maskiner kan anvendes af forskellige slægter af gramnegative bakterier direkte leverer bakterielt kodede effektorproteiner i eukaryote målceller. Mens sekretionsmaskineriet selv er stærkt bevaret, har specialiseret sæt effektor proteiner udviklet sig mellem de forskellige bakteriearter at manipulere cellulære signalveje og fremme specifikke bakterielle virulens strategier 1. I tilfælde af Yersinia, op til syv effektor proteiner, såkaldte Yops (Yersinia ydre proteiner), translokeres på værtscelle kontakt og handle sammen for at nedbryde immuncellepopulationer reaktioner såsom fagocytose og cytokinproduktion, dvs at muliggøre ekstracellulær bakteriernes overlevelse 2-4. Processen med translokation tæt kontrolleret på forskellige stadier 5. Det er fastslået, at den primære aktivering af T3SS udløses ved sin kontakt til målet cell 6. Den præcise mekanisme af denne indledning er endnu ikke belyst. I Yersinia et andet niveau af såkaldt finjustering af translokation opnås ved op- eller nedregulere aktivitet af de trådløse Rho GTP-bindende proteiner Rac1 eller RhoA. Aktivering af Rac1 f.eks invasin eller cytotoksisk nekrotiserende faktor Y (CNF-Y) fører til øget translokation 7-9, mens GAP (GTPase aktiverende protein) funktion translokeres YopE nedregulerer Rac1 aktivitet og følgelig falder translokation af en negativ feedback typen af mekanismen 10,11.
Gyldige og præcise metoder er en forudsætning for at undersøge, hvordan translokation reguleres under Yersinia værtscelle interaktion. Mange forskellige systemer har været anvendt til dette formål, hver med særlige fordele og ulemper. Nogle metoder er afhængige af lysis af inficerede celler, men ikke bakterier ved forskellige detergenter efterfulgt af Western blot-analyse. The fælles ulempe ved disse fremgangsmåder er, at mindre, men uundgåelige bakteriel lysis potentielt forurener cellelysatet med bakterier-associerede effektor proteiner. Der blev imidlertid behandling af celler med proteinase K for at nedbryde ekstracellulære effektor proteiner og efterfølgende anvendelse af digitonin til selektiv lyse af de eukaryote celler foreslået at minimere dette problem 12. Vigtigt er det, disse analyser afgørende afhængige af høj kvalitet anti-effektor antistoffer, som for det meste ikke er kommercielt tilgængelige. Forsøg på at anvende translationelle fusioner af effektor proteiner og fluorescerende proteiner som GFP at overvåge translokation ikke var vellykket sandsynligvis på grund af det kugleformede tertiære struktur af de fluorescerende proteiner og manglende evne til sekretion apparatet at udfolde dem før sekretion 13. Men flere forskellige reporter tags som den cya (calmodulin-afhængig adenylatcyclase) domæne af Bordetella pertussis toxin cyclolysin 14 eller Flashtag lykkedes anvendes til at analysere translokation. I førstnævnte assay den enzymatiske aktivitet af cya anvendes til at forstærke signalet af det intracellulære fusionsproteinet, mens Flash tag, en meget kort tetracysteine (4Cys) motiv tag, giver mulighed for mærkning med biarsenical farvestof Flash uden at forstyrre processen med sekretion 15.
Den tilgang, anvendes her blev rapporteret for første gang af Charpentier et al., Og er baseret på den intracellulære omdannelse af Forster resonans (FRET) farvestof CCF4 af omplantede effektor TEM-1 beta-lactamase fusioner 16 (figur 1A). CCF4 / AM er en celle-permeant forbindelse, hvori en coumarin-derivat (donor) og en fluorescein del (acceptor) er forbundet af en cephalosporin kerne. Ved passiv post i den eukaryote celle, ikke-fluorescerende esterificeret CCF4 / AM forbindelse behandles af cellulære esteraser, til den ladede og fluorescerende CCF4 og derved fangeti cellen. Excitation af coumarin-delen ved 405 nm resulterer i FRET til fluoresceindelen, der udsender et grønt fluorescenssignal ved 530 nm. Efter spaltning af cephalosporin kernen af beta-lactamase FRET er afbrudt og excitation af cumarin delen fører til blå fluorescensemission at460 nm. Forskellige anvendelser af denne fremgangsmåde er blevet beskrevet i litteraturen synliggøre dens alsidighed. Fremgangsmåden giver mulighed for analyse af translokation in vitro og også in vivo, fx blev den anvendte teknik i en mus infektion model til at identificere leukocytpopulationer målrettet til translokation in vivo 17-19. Kan udføres udlæsning af signaler ved hjælp af pladeaflæsere, FACS-analyse eller fluorescensmikroskopi. Af note, metoden giver også mulighed for at overvåge translokation i realtid af live-cell mikroskopi under infektionen processen 20,21. Her laserscanning fluorescens mikroskopi blev ansøgt om readout fluorescenssignaler da det giver højeste sensitivitet og nøjagtighed. Navnlig skal muligheden for at justere emission vindue med nanometer præcision i kombination med høj følsomme detektorer letter optimeret fluorescens detektion og minimeret krydstale. Derudover kan tilpasses denne mikroskopi setup for real-time overvågning af translokation og potentielt tillader til samtidig analyse af host-patogen interaktion på celleniveau.
I denne undersøgelse translokation satser af et Y. enterocolitica vildtypestamme og en YopE deletionsmutant udviser en fænotype hypertranslocator 10,11 blev eksemplarisk analyseret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi her anvendt med succes en TEM-1 beta-lactamase reporter assay til kvantitativ analyse af effektor translokation af Y. enterocolitica. Mange forskellige variationer af dette følsomme, specifikke og relativt ligetil teknik er blevet beskrevet i litteraturen. I denne undersøgelse laserscanning mikroskopi blev udført for mest følsomme og nøjagtige detektion af fluorescenssignaler. Specifikt korrektionen for krydstale mellem donor- og acceptor farvestoffer og de individuelt justerbare afsløring bå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
Materials
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia’s stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
