Analyse van<em> Yersinia enterocolitica</em> Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions
Summary
Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Abstract
Veel gram-negatieve bacteriën, waaronder pathogene Yersinia spp. Tewerk type III secretie systemen effector eiwitten verplaatsen in eukaryote doelcellen. Binnen de gastheercel de effector eiwitten cellulaire functies te manipuleren ten behoeve van de bacteriën. Om beter inzicht in de controle van het type III secretie tijdens gastheercel interactie, gevoelige en nauwkeurige tests om translocatie te meten zijn vereist. We beschrijven hier de toepassing van een assay op basis van de fusie van een Yersinia enterocolitica effector eiwitfragment (Yersinia buitenste eiwit; YopE). TEM-1 beta-lactamase voor kwantitatieve analyse van translocatie De test berust op de splitsing van een cel permeant FRET dye (CCF4 / AM) door translocatie beta-lactamase fusie. Na splitsing van het cefalosporine kern van CCF4 door de beta-lactamase, FRET van cumarine fluoresceïne wordt verstoord en excitatie van de cumarine eenheid leidt tot blauwe fluorescentie-emissie.Verschillende toepassingen van deze werkwijze zijn beschreven in de literatuur benadrukken zijn veelzijdigheid. De werkwijze maakt analyse van translocatie in vitro en in in vivo, bijvoorbeeld in een muismodel. Detectie van de fluorescentie signalen kan worden uitgevoerd met plaatlezers, FACS-analyse of fluorescentiemicroscopie. In de hier beschreven in vitro translocatie van effector fusies in HeLa-cellen door verschillende Yersinia mutanten opstelling wordt bewaakt door laser scanning microscopie. Opname intracellulaire omzetting van de FRET van de reporter door beta-lactamase fusie effector in real-time werkt krachtig kwantitatieve resultaten. We tonen hier voorbeeldgegevens, waaruit blijkt verhoogde translocatie door Y. enterocolitica YopE mutant in vergelijking met de wild type stam.
Introduction
Type III secretie systemen zijn gespecialiseerd eiwit-exportmachines gebruikt door verschillende genera van Gram-negatieve bacteriën bacterieel gecodeerde effector eiwitten rechtstreeks te leveren in eukaryote doelcellen. Terwijl de secretie machinerie zelf is sterk geconserveerd zijn gespecialiseerde reeksen effector eiwitten ontstaan tussen de verschillende bacteriesoorten cellulaire signaalwegen te manipuleren en specifieke bacteriële virulentie strategieën 1 vergemakkelijken. Bij Yersinia, maximaal zeven effector eiwitten, zogenaamde YOPS (Yersinia buitenste eiwitten), translocatie bij gastheercel contact en samenwerken om immuun cel responsen zoals fagocytose en cytokineproductie, namelijk ondermijnen, op extracellulaire overleven van de bacteriën mogelijk 2-4. Het proces van translocatie wordt streng gecontroleerd in verschillende stadia 5. Er is vastgesteld dat de primaire activering van de T3SS wordt geactiveerd door het contact met het doel cell 6. De precieze mechanisme van deze initiatie moet nog worden opgehelderd. In Yersinia een tweede niveau van zogenoemde fine-tuning van translocatie wordt bereikt door omhoog of omlaag reguleren van activiteit van de cellulaire Rho GTP-bindende eiwitten Rac1 of RhoA. Activering van Rac1 bijvoorbeeld door invasine of cytotoxische necrotiserende factor Y (CNF-Y) leidt tot een verhoogde translocatie 7-9, terwijl de GAP (GTPase activerend eiwit) functie van de translocatie YopE down-reguleert Rac1 activiteit en bijgevolg vermindert translocatie door een negatieve feedback soort mechanisme 10,11.
Valide en nauwkeurige methoden zijn een voorwaarde om te onderzoeken hoe translocatie tijdens Yersinia gastheercel interactie wordt gereguleerd. Vele verschillende systemen zijn gebruikt voor dit doel, elk met specifieke voordelen en nadelen. Sommige benaderingen afhankelijk lysis van geïnfecteerde cellen maar geen bacteriën door verschillende detergentia, gevolgd door Western blotanalyse. The gemeenschappelijke nadeel van deze methode is dat kleine, maar onvermijdelijke bacteriële lysis mogelijk vervuilt het cellysaat met bacteriën-geassocieerde effector proteïnen. Echter, behandeling van cellen met proteinase K extracellulaire effector eiwitten en het daaropvolgende gebruik van digitonine voor selectieve lysis van de eukaryotische cellen afbreken voorgesteld om dit probleem te 12 minimaliseren. Belangrijk is dat deze assays mate afhangen van hoogwaardige anti-effector antilichamen, die meestal niet in de handel verkrijgbaar. Pogingen om translationele fusies van effector eiwitten en fluorescerende eiwitten gebruiken, zoals GFP translocatie controleren waren niet succesvol waarschijnlijk door de bolvormige tertiaire structuur van het fluorescente eiwitten en het onvermogen van de secretie inrichting om te ontvouwen voor afscheiding 13. Echter, verschillende reporter tags zoals de cya (calmoduline-afhankelijk adenylaatcyclase) domein van de pertussistoxine Bordetella cyclolysin 14 of de Flash-tag werden met succes gebruikt om translocatie te analyseren. In het eerste assay de enzymatische activiteit van cya wordt gebruikt om het signaal van de intracellulaire fusieproteïne amplificeren, terwijl de Flash tag, een korte tetracysteine (4Cys) motief tag, maakt labeling met biarsenical kleurstof Flash zonder het proces van secretie verstoren 15.
De hier toegepaste aanpak werd gerapporteerd voor het eerst Charpentier et al. En is gebaseerd op de intracellulaire omzetting van de Förster resonantie energieoverdracht (FRET) kleurstof CCF4 door translocatie effector TEM-1 beta-lactamase fusies 16 (Figuur 1A). CCF4 / AM is een cel-permeant verbinding waarbij een coumarine derivaat (donor) en een fluoresceïne-groep (acceptor) worden verbonden door een cefalosporine kern. Bij passieve binnenkomst in de eukaryote cel, wordt de niet-fluorescerende veresterde CCF4 / AM verbinding verwerkt door cellulaire esterasen tot de geladen en fluorescerende CCF4 en daardoor gevangenbinnen de cel. Excitatie van de cumarine eenheid bij 405 nm resulteert in FRET het fluoresceïne groep, die een groene fluorescentie uitzendt bij 530 nm. Na splitsing van het cefalosporine kern door beta-lactamase FRET wordt verstoord en excitatie van de cumarine eenheid leidt tot blauwe fluorescentie-emissie at460 nm. Verschillende toepassingen van deze werkwijze zijn beschreven in de literatuur benadrukken zijn veelzijdigheid. De werkwijze maakt analyse van translocatie in vitro en in in vivo, bijvoorbeeld, de techniek gebruikt in een muis infectie model om de leukocyt populaties gericht voor translocatie in vivo 17-19 identificeren. Uitlezen van signalen kan worden uitgevoerd met behulp plaatlezers, FACS-analyse of fluorescentiemicroscopie. Opmerkelijk is de werkwijze ook de mogelijkheid om te controleren translocatie in real-time door levende cellen microscopie gedurende het infectieproces 20,21. Hier werd laserscanning fluorescentiemicroscopie aangevraagd readout van fluorescentiesignalen omdat het hoogste gevoeligheid en nauwkeurigheid. Met name de mogelijkheid om het uittreevenster met nanometerprecisie in combinatie met high-detectoren vergemakkelijkt fluorescentiedetectie geoptimaliseerd en minimale overspraak te passen. Daarnaast kan deze microscoop setup worden aangepast voor real-time monitoring van translocatie en mogelijk maakt voor gelijktijdige analyse van gastheer-pathogeen interactie op het cellulaire niveau.
In deze studie translocatie tarieven van een Y. enterocolitica wild type stam en een YopE deletiemutant vertonen een hypertranslocator fenotype 10,11 werden voorbeeldig geanalyseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hier succes toegepast een TEM-1 beta-lactamase reporter gebaseerde test voor de kwantitatieve analyse van effector translocatie door Y. enterocolitica. Vele andere variaties van deze gevoelige, specifieke en relatief eenvoudige techniek zijn beschreven in de literatuur. In deze studie werd laser scanning microscopie uitgevoerd voor de meest gevoelige en nauwkeurige detectie van fluorescentiesignalen. Specifiek de correctie voor overspraak tussen de donor en acceptor kleurstoffen en de individueel instelbare …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
Materials
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia’s stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
