Early Viral Entry testsystemen voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen

Summary

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Abstract

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Introduction

Viral infections are a constant threat to the public health and a significant cause of epidemic diseases, morbidity, and deaths worldwide. Specific modes of control against viral infections include vaccine development and antiviral therapies. While vaccine efforts have proven successful in immunizing against several viruses, many viral pathogens remain without a protective vaccine including dengue virus (DENV), human cytomegalovirus (HCMV), hepatitis C virus (HCV), human immunodeficiency virus (HIV), and respiratory syncytial virus (RSV)^1-5. Antivirals, on the other hand, play an important role for the management of these viral infections when prophylactic vaccines are unavailable. However, to date, only few licensed and cost-effective antiviral drugs are available compared to the number of viral pathogens that threatens the public health. More importantly, due to an increase in global travel and rapid urbanization, the situation is aggravated by risks of epidemic outbreaks from emerging/re-emerging viral infections that are being introduced into non-indigenous areas⁶. Recent outbreaks caused by severe acute respiratory syndrome (SARS) virus, influenza viruses (H1N1, H5N1, H3N2, and H7N9), DENV, West Nile virus (WNV), measles virus (MV), Middle East Respiratory Syndrome (MERS) virus, and Ebola virus^6-12 are among the examples reflecting the need for antivirals development when immunization and/or therapeutics are unavailable. In addition, there is always a potential risk of generating drug-resistant infections with currently used antivirals. Thus, the continuous development and expansion of the scope of antivirals to these emerging/re-emerging viral infections are necessary to provide better management strategies and safeguard the public health.

Most antiviral therapies consist of direct acting antivirals (DAAs) which target a specific viral protein or cofactor that mediates important steps in the viral life cycle. For example, the nucleoside analogue Acyclovir inhibits herpesvirus DNA polymerase, protease inhibitors Boceprevir and Telaprevir antagonize the HCV NS3, and Oseltamivir and Zanamivir are neuraminidase inhibitors that block the release of influenza virus particles from infected cells^13-15. There are however very few licensed viral entry inhibitors including Enfuvirtide, which targets HIV gp41 to prevent fusion, and Maraviroc, which blocks the HIV co-receptor CCR5, thereby preventing viral entry¹⁶. Exploring novel antagonists/inhibitors to viral entry could help provide additional therapeutics for prophylactic or therapeutic use, such as in combination with other antivirals with a different mechanism of action to better manage viral infections^17-19.

Identification of antivirals can involve structure-guided drug design and candidate drug screening-based strategy. Methods for assessing antiviral activity of test agents include biochemical assays of enzymatic activity and evaluation by cell-based systems^20-23. In cell-based systems, the viral life cycle can be dissected into distinct stages of infection, such as entry events (attachment, fusion, uncoating), the replication phase (viral genome replication and protein translation), and virion egress (assembly, maturation, and release). Since the assays can be adapted to investigate each specific stage using various tools and methods, this approach allows identification/examination of potential candidate antivirals with a specific mechanism of action targeting the distinct stage analyzed. For instance, to analyze drug effect specifically on the free virus particles prior to binding to the host cell, a ‘viral inactivation assay’ can be performed. In this assay, the virus is allowed to incubate with the test drug and then diluted to titrate out the drug before infecting a cell monolayer. Additional steps such as viral attachment and entry/fusion stages can also be analyzed individually, by shifting the temperature during the infection. For many enveloped viruses, viral entry/fusion at the host cell membrane is greatly facilitated at 37 °C, but is typically precluded at 4 °C which does not affect virus binding^24-29. Finally, the use of reporter viruses or cell systems could facilitate these studies and permit a high-throughput analysis.

We previously employed the cell-based approach and dissected the early entry of various enveloped viruses for the examination of antiviral compounds that potentially antagonize viral entry^30,31. Herein, the various methods used, including viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion assays, are described.

Protocol

Let op: Zorg ervoor dat alle procedures waarbij celcultuur en virusinfectie worden uitgevoerd in gecertificeerde bioveiligheid kappen, dat geschikt is voor de bioveiligheid niveau van de monsters worden behandeld zijn. Voor het beschrijven van de protocollen wordt Gaussia luciferase reporter-gelabeld HCV als model virus 32. In het kader van de representatieve resultaten zijn de verbindingen chebulagic acid (ChLA) en punicalagin (PUG) worden gebruikt als kandidaat antivirale middelen die virale glycoproteïne interacties met celoppervlak glycosaminoglycanen richten tijdens de vroege virale binnenkomst stap 31. Heparine, waarvan bekend is te interfereren met de komst van veel virussen 30,31,33,34, wordt gebruikt als een positieve controlebehandeling in dergelijke context. Voor eenvoudige achtergrond op virologie technieken, verspreiding van virussen, bepaling van de virustiter, en expressie van infectieuze dosis in plaque-vormende eenheden (PFU), richten eenheden (FFU), of een veelvoud van infectie (MOI), de lezer is redoeld referentie 35. Voorafgaande voorbeelden en geoptimaliseerde omstandigheden voor virussen in de representatieve resultaten wordt verwezen naar referenties 30-32,36-39 alsmede gegevens in tabel 1, figuur 1A en figuur 2A weergegeven. 1. Cel Cultuur, Compound Voorbereiding en Compound cytotoxiciteit Groeien de respectievelijke cellijn voor virusinfectie systeem te analyseren (tabel 1). Voor HCV, groeit de Huh-7,5-cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 200 U / ml penicilline G, 200 ug / ml streptomycine, en 0,5 ug / ml amfotericine B. Bereid de testverbindingen en controles met behulp van hun respectievelijke oplosmiddelen: bijvoorbeeld oplossen ChLA en PUG in dimethylsulfoxide (DMSO); heparine bereiden in steriel dubbel gedestilleerd water. Voor alle volgende verdunningen, gebruiken cultuur media. Opmerking: De laatste concentrantsoen van DMSO in de test verbinding behandelingen minder dan 1% in de experimenten; 1% DMSO wordt opgenomen als een negatieve controle behandeling in de assays voor vergelijking. Bepaal de cytotoxiciteit van de testverbindingen (bijv ChLA en PUG) op de cellen van de virale infectie door een cellevensvatbaarheid bepalen reagens zoals XTT (2,3-bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl] -5-fenylamino) carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide): Voor HCV, zaad Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen. Breng DMSO control (1%) en toenemende concentraties van de testverbindingen ChLA en PUG (ex. 0, 10, 50, 100 en 500 uM) aan de kweekputjes in drievoud. Incubeer bij 37 ° C gedurende 72 uur, vervolgens het medium in de plaat weggooien en was de cellen met 200 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal. Voeg 100 ul van assaying oplossing van de XTT-gebaseerde in vitro toxicologie assay kit aan elk putje en incubeer de platen bij 37 ° C gedurende nog 3 uur tot XTT laten formazanproductie. Bepaal de absorptie met een microplaat reader bij een test golflengte van 492 nm en een referentie golflengte van 690 nm. Bereken het percentage overlevende cellen met de volgende formule: levensvatbaarheid van de cellen (%) = At ​​/ Al x 100%, waarbij "in" en "Al" naar de absorptie van de testverbindingen en oplosmiddelcontrole (ex 1% DMSO. ) behandelingen, respectievelijk. Bepaal de concentratie van 50% cellulaire cytotoxiciteit (CC50) van de testverbindingen in analytisch software zoals GraphPad Prism volgens het protocol van de fabrikant. 2. Uitlezing van virale infectie Opmerking: Het uitlezen van virale infectie is afhankelijk van het virus wordt gebruikt en kunnen werkwijzen zoals plaque assays of mea betrekkensuring reporter signalen van reporter-gelabeld virussen. Werkwijze voor het detecteren van reporter-HCV-infectie op basis van het luciferase reporter-activiteit wordt hieronder beschreven. Verzamel de supernatanten van de geïnfecteerde putjes en verduidelijkt bij 17.000 xg in een microcentrifuge gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Meng 20 pl supernatant proef 50 ui luciferase substraat tegen de Gaussia luciferase assay kit en direct te meten met een luminometer volgens de instructies van de fabrikant. Express HCV infectiviteit als log 10 relatieve lichteenheden (RLU) voor het bepalen van virale remming (%) en bereken de 50% effectieve concentratie (EC50) van de testverbindingen tegen HCV-infectie via algoritmen van GraphPad Prism software volgens het protocol van de fabrikant. 3. Viral Inactivering Assay Opmerking: Voorbeelden van incubatieperiode en virale dosis voor verschillende virussen eenre weergegeven in figuur 1A. Hogere concentraties van het virus kan ook getest worden door verhoging van de MOI / PFU. Seed Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen. Incubeer de test verbindingen of controles (uiteindelijke concentraties zijn: ChLA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparine = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) met het HCV-deeltjes bij 37 ° C (Figuur 1A, 'Long-Term' ) in een 1: 1 ratio. Bijvoorbeeld, een 100 ul virus inoculum bevattende 1 x 10 4 FFU, voeg 100 ul van een 100 uM ChLA werkverdunning; Dit levert ChLA behandeling bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM. Verdun de virus-drug mengsel "subtherapeutische" (effectief) concentratie van de testverbindingen. Bijvoorbeeld, de ineffectieve concentratie ChLA en PUG tegen HCV is 1 uM 31; daaromDit vereist een 50-voudige verdunning van het virus-drug mengsel dat kan worden bereikt met 9,8 ml basismedium (celcultuur medium met 2% FBS). Opmerking: De verdunning tot subtherapeutische concentraties voorkomt significante interactie tussen de proefverbindingen en de gastheercel oppervlak en maakt onderzoek behandelingseffect op het celvrije virions. Merk op dat deze verdunning is afhankelijk van de antivirale dosis respons van de testverbindingen tegen de specifieke virale infectie, en voor het uitvoeren van deze specifieke test 31 bepaald. Ter vergelijking, meng het virus met de test verbindingen en onmiddellijk te verdunnen (geen incubatietijd) tot sub-therapeutische concentratie voorafgaand aan de infectie (Figuur 1A, 'korte termijn'). Voeg 100 ul van de verdunde HCV-geneesmiddelmengsel op de Huh-7,5 celmonolaag (de hoeveelheid virus is nu 1 x 10 2 FFU; uiteindelijke MOI = 0,01) en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C om virale toestaanadsorptie. Naar aanleiding van de infectie, verwijder de verdunde inocula en voorzichtig wassen van de putjes met 200 pl PBS tweemaal. Opmerking: Voer het wassen voorzichtig opheffen van de cellen te voorkomen. Breng 100 pi basaal medium aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 72 uur. Analyseer de resulterende infectie door testen van het supernatans van luciferaseactiviteit zoals beschreven in "2. Uitlezing van de virale infectie '. 4. Viral Attachment Assay Opmerking: Voorbeelden van incubatieperiode en virale dosis voor verschillende virussen zijn opgenomen in figuur 2A, 'Bijlage'. Hogere concentraties van het virus kan ook getest worden door verhoging van de MOI / PFU. Seed Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen. Pre-chill de celmonolagen in platen bij 4 ° C for 1 uur. Co-behandeling van de cellen met HCV inoculum (MOI = 0,01) en testverbindingen en controles (uiteindelijke concentraties: ChLA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparine = 1000 ug / ml; DMSO = 1%) bij 4 ° C gedurende 3 hr. Bijvoorbeeld, een 90 ul virus inoculum bevattende 1 x 10 2 FFU, voeg 10 ul van een 500 uM ChLA werkverdunning; Dit levert ChLA behandeling bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM en een infectie met HCV bij MOI = 0,01 op de cel monolaag. Opmerking: Het is belangrijk om het experiment uit te voeren bij 4 ° C heeft, aangezien het virus binden maar uitsluit ingang die het meest efficiënt optreedt bij 37 ° C. Voer de toevoeging van virus en testverbindingen op ijs en de daaropvolgende incubatie op 4 ° C koelkast zodat de temperatuur op 4 ° C. Verwijder het supernatant en voorzichtig wassen van de monolaag met 200 ul ijskoude PBS tweemaal. Opmerking: Voer het wassen voorzichtig opheffen van de cellen te voorkomen <./ li> Breng 100 pi basaal medium aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 72 uur. Analyseer de resulterende infectie door testen van het supernatans van luciferaseactiviteit zoals beschreven in "2. Uitlezing van de virale infectie '. 5. Virale Entry / Fusion Assay Opmerking: Voorbeeld van de incubatietijd en virale dosis voor verschillende virussen worden in figuur 2A 'Entry / Fusion' genoemd. Hogere concentraties van het virus kan ook getest worden door verhoging van de MOI / PFU. Seed Huh-7,5-cellen in een 96-putjes plaat (1 x 10 4 cellen per putje) en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator O / N om een monolaag te verkrijgen. Pre-chill de cel monolagen in platen bij 4 ° C gedurende 1 uur. Infecteren de cellen met HCV (MOI = 0,01) bij 4 ° C gedurende 3 uur. Gebruik bijvoorbeeld een 100 ul virusinoculum met 1 x 10 2 FFU. Opmerking: Voer de additie van het virale inoculum op ijs en de daaropvolgende incubatie op 4 ° C koelkast de temperatuur op 4 ° C, waarbij de virale binding, maar niet inreisvergunningen handhaven. Verwijder het supernatant en voorzichtig wassen van de cel monolagen met 200 ul ijskoude PBS tweemaal. Opmerking: Voer het wassen voorzichtig opheffen van de cellen te voorkomen. Behandel de putjes met de testverbindingen en controles (uiteindelijke concentraties: ChLA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparine = 1000 ug / ml; = 1% DMSO) en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur. Bijvoorbeeld, voeg 10 ul van een 500 uM ChLA werkverdunning tot 90 ul van de media, mengen, en behandel de putten; Dit levert ChLA behandeling bij een uiteindelijke concentratie van 50 uM. Opmerking: De verschuiving van 4 ° C tot 37 ° C maakt nu het virale entry / samensmelting en maakt derhalve de beoordeling van het effect testverbindingen 'op deze bepaalde stap. Zuig het geneesmiddel-bevattende supernatant en verwijder niet-geïnternaliseerdeextracellulaire virussen door ofwel wassen met 200 gl citraat buffer (50 mM natriumcitraat, 4 mM kaliumchloride, pH 3,0) of PBS. Breng 100 pi van het basismedium vóór incubatie bij 37 ° C gedurende 72 uur. Analyseer de resulterende infectie door testen van het supernatans van luciferaseactiviteit zoals beschreven in "2. Uitlezing van de virale infectie '.

Representative Results

In figuur 1 is de "virale inactivatie assay werd uitgevoerd om te onderzoeken of twee specifieke natuurlijke verbindingen ChLA en PUG verschillende omhulde virussen in celvrije toestand kunnen inactiveren en voorkomen daaropvolgende infectie. De cytotoxiciteit en antivirale dosis-respons van deze verbindingen zijn voor het uitvoeren van de mechanistische studie 31 bepaald. De virussen werden voorbehandeld met testverbindingen en vervolgens de virus-drug mengsels werden verdund tot subtherapeutische concentraties voor enting op de betreffende cel monolaag per virussysteem. Zoals getoond in figuur 1, zowel ChLA en PUG bleek interactie met de celvrije virions, wat resulteert in onomkeerbare effecten die de cel monolaag beschermd tegen daaropvolgende infectie. De twee test-verbindingen bereikt een bijna 100% remming tegen HCMV, HCV en DENV-2, terwijl een 60-80% blok werd waargenomen tegen MV en RSV. Deze resultaten Suggest dat ChLA en PUG hebben directe invloed op deze vrije virusdeeltjes door het inactiveren van hen en het neutraliseren van hun besmettelijkheid. In figuur 2, de bevestiging en invoer / fusion assays werden uitgevoerd om het effect van ChLA en PUG staand tegen deze vroege virale binnenkomst gerelateerde gebeurtenissen van HCMV, HCV, DENV-2, MV en RSV. Zowel ChLA en PUG effectief voorkomen binding van de onderzochte virussen op de respectieve gastheercel zoals door remming op de resulterende virale infectie (figuur 2, 'Bijlage': licht grijze balken). Het remmende effect op virus attachment door beide verbindingen was vergelijkbaar met HCMV (figuur 2B), HCV (figuur 2C), DENV-2 (Figuur 2D) en RSV (figuur 2F), variërend van 90 – 100%. Anderzijds, PUG bleek effectiever dan ChLA tegen MV binding (figuur 2E) te zijn, waarbij de remming vanaf de two verbindingen variëren tussen 50 – 80%. De controlebehandeling heparine, waarvan bekend is dat de instroming van veel virussen, remde ook de bevestiging van HCMV, DENV-2, RSV, ad MV blokkeren, maar was minder efficiënt tegen HCV. De daaruit voortvloeiende 'viral entry / fusion-test' onderzocht of ChLA en PUG behielden hun activiteit tijdens het virus entry / fusion fase (figuur 2, 'Entry / Fusion': donker grijze balken). Pas wanneer beide ChLA en PUG waargenomen effectief beïnvloeden het virale entry / smelttrap van de onderzochte virussen (Figuur 2B – F), waarbij een 50 – 90% beschermend effect op de respectievelijke cel monolaag. Heparine ook krachtig geremd invoer / fusion in DENV-2 en RSV-infecties, maar was minder effectief tegen HCMV, HCV, en MV (<40% remming gemiddeld). Virus Cel Type HCMV <td> HEL HCV Huh-7.5 DENV-2 Vero MV CHO-SLAM RSV HEp-2 Tabel 1:. Gastheercel type voor virusinfectie Het gebruikte celtype voor elk viraal infectiesysteem in de representatieve resultaten beschreven aangegeven. Verdere details met betrekking tot de cellen zijn te vinden in referentie 31. Figuur 1. Inactivatie van virale infecties door de testverbindingen ChLA en PUG Verschillende virussen werden behandeld met de testverbindingen gedurende een lange periode. (Gedurende 1,5 – 3 uur voor titratie lichtgrijze staven) of korte (direct verdund; donkergrijs bars) bij 37 ° C bij een verdunning tot subtherapeutische concentratiestie en daaropvolgende analyse van besmetting van de respectieve gastheercellen. (A) Schema van het experiment (links getoond) met de laatste virusconcentratie (PFU / well of MOI), langdurige virus-drug incubatieperiode (i), en daaropvolgende incubatietijd (ii) aangegeven voor elk virus in de tabel rechts. Analyses voor (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, en (F) RSV worden in elke extra paneel. De resultaten worden uitgezet tegen de DMSO negatieve controle behandeling van virusinfecties en de getoonde data zijn gemiddelden ± standaardfouten van het gemiddelde (SEM) van drie onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is aangepast uit referentie 31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2. Evaluatie van antivirale activiteiten van de testverbindingen ChLA en PUG tegen virussen bevestiging en invoer / fusion. (A) De experimentele procedure virusconcentratie (PFU / well of MOI) en het tijdstip van toevoeging en behandeling met testverbindingen (i, ii, iii) worden voor elk virus in de schema's en de bijbehorende tabellen. In virus attachment analyse (lichtgrijze staven), monolagen van verschillende celtypes was voorgekoeld bij 4 ° C gedurende 1 uur, vervolgens co-behandeling met deze virussen en testverbindingen bij 4 ° C (1,5 – 3 uur; i) voor het wassen van de ent en de testverbindingen voor daaropvolgende incubatie (37 ° C, ii) en onderzoek van virusinfectie. In virusingang / fusion analyse (donker grijze balken), geënte celmonolagen waren voorgekoeld bij 4 ° C gedurende 1 uur en daarna geprikkeld met deze virussen bij 4 ° C gedurende 1,5 – 3 uur (i). Cellen werden vervolgensgewassen en behandeld met de testverbindingen tegen incubatieperiode (ii) waarbij de temperatuur werd verschoven naar 37 ° C om het virale entry / samensmelting vergemakkelijken. Aan het einde van de incubatie werden extracellulaire virussen verwijderd door een citraatbuffer (pH 3,0) of PBS wast en de cellen werden verder geïncubeerd (iii) voor de analyse van virusinfectie. Resultaten voor (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, en (F) RSV worden in elke extra paneel. Gegevens worden uitgezet tegen de DMSO negatieve controle behandeling van virusinfecties en worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is aangepast uit referentie 31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

In this report the methods to identify and evaluate antiviral compounds based on a mechanistic approach of dissecting the early viral entry events were described. Specifically, the assays allowed us to examine the effect of test compounds on free virus particles, viral attachment, and viral entry/fusion. Critical steps were implemented to distinctly evaluate the drug effect on the specific stage of early viral entry. For instance, in the ‘viral inactivation assay’, the dilution of the virus-drug mixture to sub-therapeutic concentration prevents significant interaction between the test compound and the host cell surface by ‘titrating out’ the drug. This ensures that the inhibitory effect observed on the subsequent infection of the host cell is due to a direct interaction between the test compound and the cell-free virions, rather than an effect from the test compound on host cell membrane or membrane-associated molecules, including viral receptors³⁰. Similarly, the shift in temperature between 4 °C (which allows for virus binding but not entry) and 37 °C (which facilitates virus entry/fusion) in the ‘viral attachment assay’ and ‘viral entry/fusion assay’ are crucial to determine the test compound’s effect on each of these specific events. This is feasible due to the temperature sensitivity of enveloped viruses during these steps in the infection^24-29. It is therefore important that the assays are performed at the indicated temperature to ensure the accuracy of the results; for example, by carrying out the experiment on ice to maintain at 4 °C and by placing the sample directly in a 37 °C incubator for the temperature shift. In addition, the use of negative (ex. DMSO solvent for drug preparation) and positive (ex. heparin treatment) controls also help further establish the assays’ accuracy. The utility and applicability of such methods have been demonstrated in many antiviral studies^{26,30,31,40,41}. Note that while heparin is included as a control for all three assays in the context of the representative results, it typically blocks the initial virus binding rather than the ensuing fusion/entry step (as reflected by the data in Figure 2). Additional controls could also be used, such as neutralizing antibodies directed against the virus (for viral inactivation assay), antibodies that mask the cell surface receptors for the virus (for viral attachment assay), and membrane fusion inhibitors (for viral fusion/entry assay).

The assays described in this report, which are specific to the early stages of the viral infection, are useful in terms of application as secondary tests to characterize the mechanism of action of candidate drugs from primary screens which typically target the viral infection more broadly. Alternatively, they could also be incorporated in primary screens if one is specifically looking for inhibitors of early viral entry, including virus inactivating agents, viral attachment antagonists, and inhibitors to viral entry/fusion. In this case, their use allows a more focused and precise screen analysis for the identification of mechanism-specific antiviral candidates, which, in turn, would expedite downstream drug development.

The use of cell-based assays in identifying antiviral agents provides several important advantages compared to biochemical assays, including revealing potential off-target effects (such as cytotoxicity) and adding physiological relevance to the bioactivity of the test agents⁴². These issues are important considerations for deciding whether a candidate agent is of value for continuation in subsequent phases of drug development. Similarly, the early viral entry-specific assays described in this report allow examination of the drug effect on the distinct viral entry stage at the cellular level, and more specifically in the context of an authentic viral infection in vitro. The results obtained from such assays would therefore help better predict the antiviral efficacy of the test compounds and also identify potentially unwanted off-target effects against the host cell. One potential limitation though, is that an in vitro cell-based assay may not completely reflect the actual in vivo entry step in the context of a natural viral infection. Nonetheless, the assays presented in this protocol do serve as an analytical platform for mechanism-based identification and evaluation of novel antiviral agents.

The development of reporter viruses or reporter cell systems to quantitate the amount of viral infection has greatly facilitated cell-based screening and evaluation of antiviral compounds. Examples include the use of recombinant viruses carrying a reporter gene or by means of recombinant human cell lines containing a reporter gene driven by the specific virus promoter^31,43. In this report, the infection from luciferase-tagged HCV can be easily monitored by quantitating the reporter signal, thus facilitating data analysis. By incorporating these useful reporter-based tools, the early viral entry assays described here can essentially be adapted into high-throughput format for mechanism-based screening of small molecule libraries.

In conclusion, a protocol was described for assays dissecting the early viral entry as a means of identifying and evaluating mechanism-specific antiviral compounds. Such assays would be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to viral entry and help expand the scope of antiviral agents for development as prophylactic and/or therapeutic treatments.

Materials

DMEM	GIBCO	11995-040
FBS	GIBCO	26140-079
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070-063
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
DMSO	Sigma	D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based	Sigma	TOX2
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
Microplate reader	Bio-Tek Instrument, Inc.	ELx800
Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit	New England Biolabs	E3300L
Luminometer	Promega	GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate	Sigma	71402
Potassium chloride	Sigma	P5405