Подготовка митохондриальных Обогащенный фракций для метаболического анализа в<em> Drosophila</em
Summary
Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.
Abstract
Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.
Introduction
Цель этой процедуры заключается в разработке обогащенных фракций митохондрий, которые дают достаточно митохондриальных метаболитов для метаболомики исследований с использованием дрозофилы. По нашему опыту, метаболомика анализа, используя весь методы извлечения сотовой неспособны обнаружить тонкие изменения митохондрий метаболитов в дрозофилы. Тем не менее, митохондриальная дробление до анализа Метаболомика повышает чувствительность для выявления митохондриальных метаболитов сдвиги.
Митохондрии клеточные органеллы, ответственные за обеспечение 90% энергии, что клетки необходимо для нормальной функции 1. В последние годы было признано, что митохондрии играют гораздо более активную роль в клеточном и организменном функции, чем просто производство аденозинтрифосфата (АТФ), и в настоящее время признается в качестве центров для регуляции метаболического гомеостаза 2,3. Митохондрии являются результатом процесса, в котором эндосимбиотических DISдалась отчетливая микробные клоны объединены ~ 1,5 млрд лет назад 4. Как митохондрии превратилась в истинных органелл, гены от эндосимбионта были включены в формирующемся ядерного генома. У животных сегодня, примерно в 1500 митохондриальные белки кодируются ядерным, а 37 генов остаются в мтДНК, 13 из которых кодирует митохондриальные белки, которые субъединицы ферментных комплексов окислительного фосфорилирования 5. Координация между митохондриями и ядерных отсеков необходим для поддержания надлежащего функции митохондрий.
Используя методы, описанные здесь, мы были в состоянии обнаружить митохондриальных метаболические изменения в дрозофилы, которые являются результатом манипуляции координации между митохондриальных геномов и ядерных. Мы использовали штамм дрозофилы, в котором мтДНК от своих побратимов видов Д. simulans был сделан на одном D. MELANOGASTER ядерной фон 6. Это "нарушается" mitonuclearгенотип по сравнению с "родной", или совместно эволюционировали mitonuclear генотипа D. MELANOGASTER неся же ядерный геном с его родной D. MELANOGASTER мтДНК. Д. MELANOGASTER и D. simulans мтДНК отличается от ~ 100 аминокислоты и> 500 синонимичные замены, которые влияют mitonuclear 7,8 связи. Мы создали целые лету экстракты и митохондриальных обогащенных экстрактов для изучения метаболитов сдвиги в ответ на фармакологическое стресса. Здесь мы показываем, что при использовании обогащенного митохондриальные фракции мы обнаруживаем выраженные сдвиги в митохондриальных метаболитов между родной, со развивались генотипа несущей D. MELANOGASTER мтДНК и разрушенные генотип, несущие D. simulans мтДНК. В противоположность этому, изменения метаболитов между этими двумя генотипами являются тонкими, используя обычные методы, которые используют весь экстракт лету. Таким образом, этот метод обеспечил путь понять, как мтДНК посредником митохондриальные измененияОтвет на разных препаратов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги в этом протоколе, являются: 1) воспитание достаточно мух в изобилии пространства. Это очень важно, чтобы не перенаселять демография клетки с более чем 150 мух каждый; 2) изменение пищу клеток часто, чтобы избежать пищевой конкуренции и питания стресс; и 3) поддержание вс…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.
Materials
| 0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 liter cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 liter cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
- Scheffler, I. E. . Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria–a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -. T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
