Summary

Photothrombosis الناجم عن نقص التروية التنسيق نموذجا من اصابات الحبل الشوكي في الفئران

Published: July 16, 2015
doi:

Summary

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Abstract

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Introduction

إصابات الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) هو شرط السريرية المدمرة التي تؤثر الحسية واللاإرادي وظائف SC. وغالبا ما تترك المرضى على قيد الحياة SCI مع المنهكة الشلل النصفي الذي يؤثر بشكل كبير على نشاطاتهم اليومية ونوعية الحياة 1. وكانت النماذج التجريبية SCI أداة لا غنى عنها في التحقيق العلمي لفهم الفيزيولوجيا المرضية لاصابات النخاع الشوكي وعمليات إصلاح العصبية المرتبطة بها. كما تم استخدام هذه النماذج لاختبار فعالية قبل السريرية لمختلف التدخلات اعصاب التجريبية التي تهدف إلى الانتعاش وظيفية. حاليا، معظم النماذج SCI في ممارسة توظف استخدام القوة الفظة المادية لتعطيل ميكانيكيا وتجرح SC. وتشمل هذه الأساليب كدمة، وضغط، والتفكك وtransection من SC 2. فقد قيل أنه بعد إهانة الميكانيكية الأولية لإصابة ثانوية في شكل مجموعات نقص التروية في في SC المصاب 3،4. المسببات لنقص التروية الثانوي ويشمل انحطاط واسعة الأنسجة، ونزف متني وأحيانا انسداد الأوعية الدموية بنسيج ذمة 5-7. نتيجة الإصابة الثانوية يتأثر سلامة SC أبعد من ذلك، يتم تخفيض قيمة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية بشدة في وظيفة وقدرتها على البقاء وتمر الخلايا مما يؤدي إلى احتشاء النمو خلال المرحلة المزمنة من الإصابة، مماثلة لنمو غبش الدماغية السكتة الدماغية التالية 8،9. وقد تم الإبلاغ عن العديد من الآليات مثل التحفيز الزائدة، إنتاج الجذور الحرة، والتهاب ليكون مسؤولا عن موت الخلايا الدماغية التالية SCI 10،11. بالإضافة إلى ذلك، SC نقص التروية هو من مضاعفات خطيرة من جراحات إصلاح الأبهر الصدري البطن التي غالبا ما تؤدي إلى الشلل النصفي في المرضى 12،13. على الرغم من هذا التأثير السريري عالية تتوفر حاليا نماذج قليلة جدا من نقص التروية الحبل الشوكي مع استنساخ عالية.

الإقليم الشمالي "> Photothrombosis (PT) هو طريقة تستخدم عادة للتحريض نقص التروية التنسيق في الدماغ 14-20. هذه التقنية إلى حد ما غير الغازية، استنساخه للغاية وتنتج الآفة الدماغية التنسيق الدقيق في المنطقة المكشوفة من الدماغ 17 -21. ويتحقق ذلك عن طريق الإدارة النظامية الأصباغ متفاعل مثل روز البنغال (RB) 16-20،22 أو erythrosine B 23 تليها تشعيع المترجمة من الأوعية الدموية مع مصدر ضوء مناسب. تنشيط ضوئي من الصبغة يتسبب في توليد الجذور الحرة التي تعطيل سلامة بطانة الأوعية الدموية على نحو سلس، وتتسبب في الصفائح الدموية لتتراكم، والتي تشكل في وقت لاحق الجلطة. وإعاقة تدفق الدم من خلال نتائج خثرة في احتشاء في المنطقة التي قدمتها السفينة 24. ونظرا لسهولة السيطرة على كثافة ومدة التشعيع هذا الإجراء غلة احتشاء موحد للغاية وقابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم للحث على infarct في مختلف المواقع التشريحية تمكين المكاني (على سبيل المثال، المادة الرمادية مقابل المادة البيضاء) فهم تأثير نقص التروية.

الهدف من الدراسة الحالية هو تطوير نموذج سهل وتكرار للغاية من SC نقص التروية في الفئران. وصفنا الداخلي للنموذج PT من SC نقص التروية في الفئران. أظهرت النتائج من الأنسجة والمناعية التي يمكن أن تحفز على نحو فعال PT SC احتشاء، وفقدان الخلايا العصبية ودباق رد الفعل.

Protocol

ملاحظة: الفئران (C57BL / 6J، الذكور) الذين تتراوح أعمارهم بين واستخدمت 12 أسبوعا في هذه الدراسة – 10. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل جامعة ميسوري المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخ…

Representative Results

وكان الهدف من هذه الدراسة لإنتاج نقص التروية الحبل الشوكي في الفئران باستخدام نموذج PT. بعد المنطقة المطلوب من العظم فوق الحبل الشوكي (T10 – T12) وضعفت، تم حقن روز البنغال خلال الرجعية المدارية الجيوب الأنفية الطريق، وكان المستحث نقص التروية قبل PT الشكل 1A، B تظهر …

Discussion

في هذه الدراسة، وصفنا نموذجا photothrombotic من SC نقص التروية. بسبب التقدم في مجال الهندسة الوراثية وكانت هناك زيادة في الفئران المعدلة وراثيا المتاحة تجاريا التي جعلت من الممكن لدراسة تأثير جينات معينة تشارك في الفيزيولوجيا المرضية الدماغية في SC. وكان الهدف من هذ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [منحة لا. R01NS069726] وجمعية القلب الأميركية في منح المعونة منحة [منحة لا. 13GRNT17020004] إلى SD.

Materials

 Rose Bengal Sigma-Aldrich 330000 20 mg/ml in sterile saline
C57Bl6/J Jackson lab 664 22-25g
Ketamine  VEDCO NDC-50989-996-06 100 mg/ml
Xylazine  VEDCO NDC-50989-234-11 100 mg/ml
Betadine solution Purdue NDC-67618-150-01 10% povidone iodine topical solution
Normal saline Abott Laboratories 04930-04-10 For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying
Artificial tears ointment  Rugby NDC-0536-6550-91 83% white petrolatum
Ethanol Decon labs.Inc 2716 70% ethanol for disinfection
Metal halide lamp EXFO, Canada X-Cite 120 PC  Set power at 12%
Spring scissors  Fine Science Tool 15000-10 for minor dissection
Scissors (angled to side) Fine Science Tool 14063-011 No. 3 handle
Standard scalpel Fine Science Tool 10003-12 for removing muscle
Scalpel blade Feather 2976 No. 10
Forceps (curved) Fine Science Tool 11150-10 for holding tissue
Forceps (straight) Fine Science Tool 11151-10 for holding tissue
Needle holder  Fine Science Tool 12002-12 for suturing
Tissue adhesive glue 3M Vetbond 1469SB to adhere to edges of the cut skin
Monofilament polypropylene  USSC Sutures VP-521 Size = 4-0 (for fascia)
Perma-hand silk Ethicon 683G Size = 4-0 (for skin)
Micro drill Roboz Surgical Instrument Co. Inc. RS-6300 with bone polishing drill bit
Laser doppler flowmeter Moor Instruments moorVMS-LDF1 for monitoring change in blood flow
Heating pad Fine Science Tool 21052-00 to prevent hypothermia
Lab-Jack Fisher scientific  14-673-50 4×4 in plate to adjust the height of the animal
X-Y gliding stage  Amscope GT100 for positioning the animal under microscope  

References

  1. Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
  2. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  3. Young, W. Secondary injury mechanisms in acute spinal cord injury. J Emerg Med. 11, 13-22 (1993).
  4. Crowe, M. J., Bresnahan, J. C., Shuman, S. L., Masters, J. N., Beattie, M. S. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat Med. 3 (1), 73-76 (1997).
  5. Soubeyrand, M., et al. Effect of norepinephrine on spinal cord blood flow and parenchymal hemorrhage size in acute-phase experimental spinal cord injury. Eur Spine J. 23 (3), 658-665 (2014).
  6. Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (2012).
  7. Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis). Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
  8. Liu, X. Z., et al. Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury. J Neurosci. 17 (14), 5395-5406 (1997).
  9. Liu, L., et al. An experimental study of cell apoptosis and correlative gene expression after tractive spinal cord injury in rats. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 42 (23), 1434-1437 (2004).
  10. Hirose, K., et al. Activated protein C reduces the ischemia/reperfusion-induced spinal cord injury in rats by inhibiting neutrophil activation. Ann Surg. 232 (2), 272-280 (2000).
  11. Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
  12. Guerit, J. M., Dion, R. A. State-of-the-art of neuromonitoring for prevention of immediate and delayed paraplegia in thoracic and thoracoabdominal aorta surgery). Ann Thorac Surg. 74 (5), S1867-S1869 (2002).
  13. Schepens, M. A., Heijmen, R. H., Ranschaert, W., Sonker, U., Morshuis, W. J. Thoracoabdominal aortic aneurysm repair: results of conventional open surgery. Eur J Vasc Endovasc Surg. 37 (6), 640-645 (2009).
  14. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp Transl Stroke Med. 1, 8 (2009).
  15. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
  16. Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 1. Time course of hemodynamic consequences. J Cereb Blood Flow Metab. 6 (2), 184-194 (1986).
  17. Zhang, W., et al. Neuronal protective role of PBEF in a mouse model of cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (12), 1962-1971 (2010).
  18. Li, H., Zhang, N., Sun, G., Ding, S. Inhibition of the group I mGluRs reduces acute brain damage and improves long-term histological outcomes after photothrombosis-induced ischaemia. ASN Neuro. 5 (3), 195-207 (2013).
  19. Li, H., et al. Histological, cellular and behavioral assessments of stroke outcomes after photothrombosis-induced ischemia in adult mice. BMC Neurosci. 15, 58 (2014).
  20. Wang, T., Cui, W., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2 (1), 33-42 (2010).
  21. Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J Neurosci Methods. 117 (1), 43-49 (2002).
  22. Boquillon, M., Boquillon, J. P., Bralet, J. Photochemically induced, graded cerebral infarction in the mouse by laser irradiation evolution of brain edema. J Pharmacol Toxicol Methods. 27 (1), 1-6 (1992).
  23. Kim, G. W., Lewen, A., Copin, J., Watson, B. D., Chan, P. H. The cytosolic antioxidant, copper/zinc superoxide dismutase, attenuates blood-brain barrier disruption and oxidative cellular injury after photothrombotic cortical ischemia in mice. Neuroscience. 105 (4), 1007-1018 (2001).
  24. Schmidt, A., et al. Photochemically induced ischemic stroke in rats. Exp Transl Stroke Med. 4 (1), 13 (2012).
  25. Lang-Lazdunski, L., et al. Spinal cord ischemia. Development of a model in the mouse. Stroke. 31 (1), 208-213 (2000).
  26. Wang, Z., et al. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J Neurosci Methods. 189 (2), 246-251 (2010).
  27. Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. J Vis Exp. (76), (2013).
  28. Lu, H., et al. Induction and imaging of photothrombotic stroke in conscious and freely moving rats. J Biomed Opt. 19 (9), 96013 (2014).
  29. Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Front Neuroenergetics. 6 (1), (2014).
  30. Bell, M. T., et al. Toll-like receptor 4-dependent microglial activation mediates spinal cord ischemia-reperfusion injury. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S152-S156 (2013).
  31. Smith, P. D., et al. The evolution of chemokine release supports a bimodal mechanism of spinal cord ischemia and reperfusion injury. Circulation. 126 (11 Suppl 1), S110-S117 (2012).
  32. Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50 (4), 264-274 (2012).

Play Video

Cite This Article
Li, H., Roy Choudhury, G., Zhang, N., Ding, S. Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice. J. Vis. Exp. (101), e53161, doi:10.3791/53161 (2015).

View Video