Brug af Konfokal Analyse af<em> Xenopus laevis</em> At Undersøg Modulatorer af Wnt og Shh Morfogen Gradienter
Summary
Manuskriptet her giver et simpelt sæt af metoder til analyse sekretion og udbredelse af fluorescens mærkede ligander i Xenopus. Dette giver en kontekst for at afprøve, om andre proteiner for at modificere ligand distribution og tillade eksperimenter, der kan give indsigt i mekanismer, der regulerer morfogen gradienter.
Abstract
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at visualisere ligander fordelt på et felt af celler. Den lethed at udtrykke eksogene proteiner, sammen med den store størrelse af deres celler i tidlige embryoner, gør Xenopus laevis en nyttig model til at visualisere GFP-mærkede ligander. Syntetiske mRNA'er translateres effektivt efter injektion i det tidlige stadie Xenopus embryoner og injektioner kan målrettes til en enkelt celle. Når det kombineres med en slægt sporstof såsom membran tøjret RFP, kan den injicerede celle (og dens efterkommere), der producerer det overudtrykte protein let følges. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af fluorescens mærkede Wnt og Shh-ligander fra injiceret mRNA. Metoderne involverer miCRO dissektion af ektodermale eksplantater (animalsk hætter) og analyse af ligand diffusion i flere prøver. Ved at anvende konfokal billeddannelse, kan information om ligand sekretion og diffusion over et felt af celler opnås. Statistiske analyser af konfokal billeder giver kvantitative data om formen af ligand gradienter. Disse metoder kan være nyttige for forskere, der ønsker at afprøve virkningerne af faktorer, der kan regulere formen af morfogen gradienter.
Introduction
I den tidlige fosterudvikling celler gradvist forpligtet til at følge specifikke slægter af differentiering: det betyder en gruppe af totipotent (eller pluripotente) celler bliver gradvist begrænset til oprettelse populationer af stamceller bestemt at give anledning til én celletype. Celle-celle signalering er central for reguleringen af afstamning specifikation under fosterudviklingen. Manipulation af disse signaler vil være forpligtet til at lede stamceller mod bestemte skæbner til at støtte nye medicinske behandlinger.
Et forholdsvis lille antal signalveje er gentaget under udvikling, herunder veje reagerer på TGF overfamilien (nodals og BMP'er) 1-2, FGF'er 3, Wnts 4, og pindsvin 5. Disse secernerede proteiner binder receptorer til stede på cellemembranen for at aktivere signaltransduktion derved ændrer genekspression og / eller celle adfærd. Den stramme regulering af celle tegnAlling er afgørende for cellelinie specifikation og normal udvikling. Mens krydstale blandt disse veje er vigtig ved bestemmelse celleskæbnen, kan en enkelt ligand selv fremkalde distinkte reaktioner ved forskellige koncentrationer. Morfogen gradienter blev beskrevet over 100 år siden som en teori til at forklare, hvordan forskellige celletyper kan stamme fra et felt af celler 6. Signalering molekyler produceres af en gruppe af celler kan diffundere over et bestemt interval, faldende koncentrationen med en større afstand fra kilden. Celler udsat for signalet vil reagere på den lokale koncentration på deres position inden for celler, med celler ved forskellige positioner reagerer forskelligt på forskellige niveauer af signalet. Beviser for eksistensen af morfogener kommer fra studier af det tidlige embryo Drosophila 7 og vingen skiven 8, samt hvirveldyr lemmer 9 og neuralrøret 10.
Fremgangsmåder er nødvendige ivestigate hvordan morfogen gradienter er etableret, og at identificere andre molekyler vigtige i reguleringen af disse stigninger. Elegante eksperimenter under anvendelse af immunhistokemi at visualisere endogene proteiner in vivo i forbindelse med forskellige genetiske baggrunde er blevet anvendt til at undersøge morfogen gradienter 11-12. Men gode antistoffer og specifikke mutanter er ikke altid tilgængelige, så vi beskriver her en protokol ved hjælp af overekspression af fluorescerende ligander i Xenopus, at tilvejebringe en alternativ, enkel metode til at dissekere hvordan eksogene genprodukter kan påvirke fordelingen af ligander over en mark af celler. Xenopus laevis giver en fremragende system til at foretage disse typer af eksperimenter som deres embryoner udvikler eksternt, så de er tilgængelige på de tidligste stadier. Deres store størrelse (1-1.5mm i diameter) forenkler mikroinjektion og kirurgisk manipulation og blastulaen stadier cellerne er nemme at billedet som stadig er forholdsvis store (ca. 2081 m på tværs). Overekspression studier i Xenopus er enkle at gøre: mRNA indsprøjtes i den tidlige embryo kan målrettes til specifikke celler og er translateres effektivt.
De fluorescerende mærkede Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP konstruktioner blev frembragt under anvendelse pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 og eGFP. HA-peptid er vigtigt at inkludere, ikke kun for at tilvejebringe en yderligere molekylemærkning, men også fordi det menes at fungere som en spacer adskille Wnt og eGFP proteiner tillader både genprodukter til at fungere. Konstruktionen anvendes til visualisering af Shh er tidligere blevet anvendt til at danne en transgen mus som udtrykker et Shh-eGFP fusionsprotein 15; dette blev venligst stillet til rådighed af Andy McMahon. Det er vigtigt, er GFP tag for alle konstruktioner klonet 3 'for signalsekvensen, således at den fastholdes efter forarbejdning. Det er også vigtigt at sikre, at den endelige protein indeholder sekvenser, der kræves for modifikationer, såsom den Ydn af lipider som det er tilfældet for Shh og Wnt ligands.The cDNA'er blev subklonet ind i pCS2 + ekspressionsvektor, som er optimeret til brugsdyr af syntetisk mRNA; det indeholder en SP6-promotor og polyadenyleringssignal (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
Den her beskrevne arbejde giver en enkel protokol til at sammenligne sekretion og diffusion af fluorescens-mærkede Wnt og Shh mærkede ligander. Ved at injicere definerede mængder af syntetisk mRNA, protokollen circumnavigates problemer forbundet med variabel ekspression fra forskellige vektorer under anvendelse af forskellige promotorer. Disse metoder er for nylig blevet anvendt til at undersøge virkningerne af den heparansulfat endosulfatase Sulf1 på Shh-eGFP og Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP sekretion og diffusion i Xenopus 16-17.
Protocol
Representative Results
Discussion
En væsentlig del af denne protokol genererer biologisk aktive ligander, der normalt forarbejdes, udskilles, og i stand til at fremkalde en reaktion i den modtagende celle, trods en fluorescerende del knyttet. Det er afgørende at fastslå, at fluorescens-mærket genprodukt er biologisk aktiv anvendelse af et passende assay. For Shh-GFP, blev evnen til at aktivere ekspressionen af PTC1 bekræftet 16. Wnt8a har en bemærkelsesværdig potent evne til at fremkalde en sekundær akse, når det udtrykkes i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af en BBSRC indrømmer MEP (BB / H010297 / 1), en BBSRC kvote studentship til SAR, og en MRC studentship til SWF.
Materials
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | N/A | N/A | Free download http://fiji.sc/Fiji |
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | N/A | http://www.photoshop.com/products |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer – M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | N/A | N/A | homemade |
| Zen lite software | Carl Zeiss | N/A | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
References
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. . FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics : A biologist’s guide. , (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).
