Confocal विश्लेषण का उपयोग करना<em> Xenopus laevis</em> Wnt और श्श्श Morphogen ढ़ाल के Modulators जांच
Summary
पांडुलिपि यहाँ Xenopus में fluorescently टैग ligands के स्राव और प्रसार का विश्लेषण करने के लिए तरीके का एक सरल सेट प्रदान करता है। इस ligand वितरण को संशोधित करने के लिए अन्य प्रोटीन की क्षमता का परीक्षण और morphogen ढ़ाल के विनियमन तंत्र में जानकारी दे सकता है कि प्रयोगों की अनुमति के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है।
Abstract
इस प्रोटोकॉल कोशिकाओं की एक क्षेत्र भर में वितरित ligands कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन है। एक साथ जल्दी भ्रूण में उनकी कोशिकाओं के बड़े आकार के साथ, बहिर्जात प्रोटीन व्यक्त करने में आसानी, Xenopus GFP टैग ligands दृश्यमान करने के लिए एक उपयोगी मॉडल laevis बनाते हैं। सिंथेटिक mRNAs कुशलता से प्रारंभिक चरण Xenopus भ्रूण में इंजेक्शन के बाद अनुवाद कर रहे हैं, और इंजेक्शन के लिए एक एकल कोशिका को निशाना बनाया जा सकता है। ऐसी झिल्ली सीमित आरएफपी के रूप में एक वंश दरियाफ्त के साथ संयुक्त, overexpressed प्रोटीन पैदा कर रहे हैं कि इंजेक्शन सेल (और उसके वंश) आसानी से पीछा किया जा सकता। इस प्रोटोकॉल के उत्पादन के लिए एक विधि के fluorescently इंजेक्ट mRNA से Wnt और श्श्श ligands टैग किया वर्णन करता है। तरीकों मील शामिलबहिर्जनस्तरीय explants (पशु टोपी) और कई नमूने में ligand प्रसार के विश्लेषण के सीआरओ विच्छेदन। Confocal इमेजिंग का उपयोग करके, कोशिकाओं की एक क्षेत्र से अधिक ligand के स्राव और प्रसार के बारे में जानकारी प्राप्त की जा सकती है। Confocal छवियों के सांख्यिकीय विश्लेषण ligand ढ़ाल के आकार पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करते हैं। इन विधियों morphogen ढ़ाल के आकार को नियंत्रित कर सकते हैं कि कारकों के प्रभाव का परीक्षण करना चाहते हैं, जो शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है।
Introduction
जल्दी भ्रूण के विकास के दौरान कोशिकाओं उत्तरोत्तर भेदभाव की विशिष्ट प्रजातियों का पालन करने के लिए प्रतिबद्ध हैं: इस totipotent (या pluripotent) एक प्रकार की कोशिका को जन्म देने के लिए चुना गया पूर्वज कोशिकाओं की आबादी की स्थापना के लिए धीरे-धीरे ही सीमित हो जाते हैं कोशिकाओं का एक समूह होता है। सेल सेल संकेतन भ्रूण के विकास के दौरान वंश विनिर्देश के नियमन के लिए केंद्रीय है। इन संकेतों के हेरफेर उपन्यास चिकित्सा उपचार का समर्थन करने के लिए विशेष रूप से भाग्य की ओर स्टेम कोशिकाओं को निर्देशित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा।
रास्ते संकेतन की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या TGF superfamily (nodals और BMPs) 1-2, FGFs 3, Wnts 4, और hedgehogs 5 का जवाब रास्ते सहित विकास के दौरान इस बात को दोहराया जाता है। ये स्रावित प्रोटीन जिससे जीन अभिव्यक्ति और / या सेल व्यवहार में फेरबदल संकेत पारगमन को सक्रिय करने की कोशिका झिल्ली पर उपस्थित रिसेप्टर्स बाँध। सेल साइन की तंग विनियमनAlling सेल वंश विनिर्देश और सामान्य विकास के लिए आवश्यक है। इन रास्ते के बीच परस्पर बात सेल भाग्य का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है, एक भी ligand खुद को अलग सांद्रता में अलग प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना कर सकते हैं। Morphogen ढ़ाल प्रकार की कोशिकाओं कोशिकाओं 6 के एक क्षेत्र से प्राप्त कर सकते हैं कि किस तरह अलग समझाने के लिए एक सिद्धांत के रूप में 100 से अधिक साल पहले वर्णित किया गया। कोशिकाओं के एक समूह द्वारा उत्पादित अणुओं सिग्नलिंग स्रोत से अधिक दूरी के साथ एकाग्रता में कमी, एक निश्चित सीमा से अधिक फैलाना सकता है। संकेत करने के लिए संपर्क में कोशिकाओं अलग पदों पर कोशिकाओं संकेत के विभिन्न स्तरों के लिए अलग जवाब के साथ कोशिकाओं के क्षेत्र में अपनी स्थिति पर स्थानीय एकाग्रता का जवाब देंगे। Morphogens के अस्तित्व के लिए साक्ष्य जल्दी ड्रोसोफिला भ्रूण 7 और पंख डिस्क 8, साथ ही कशेरुकी अंग 9 और न्यूरल ट्यूब 10 के अध्ययन से आता है।
के तरीके में करने की जरूरत हैस्थापित कर रहे हैं कि कैसे morphogen ढ़ाल vestigate और इन ढ़ाल को विनियमित करने में महत्वपूर्ण अन्य अणुओं की पहचान करने के लिए। विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संदर्भ में इन विवो में अंतर्जात प्रोटीन कल्पना करने immunohistochemistry का उपयोग सुरुचिपूर्ण प्रयोगों morphogen ढ़ाल 11-12 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। लेकिन, अच्छी एंटीबॉडी और विशिष्ट म्यूटेंट हमेशा उपलब्ध नहीं हैं, इसलिए हम एक वैकल्पिक, exogenous जीन उत्पादों की कोशिकाओं के एक क्षेत्र भर में ligands के वितरण को प्रभावित कर सकते हैं कि कैसे काटना करने के लिए सरल तरीका प्रदान करने के लिए, Xenopus में फ्लोरोसेंट ligands की overexpression प्रयोग कर के एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। Xenopus laevis वे शुरुआती दौर में पहुंच रहे हैं तो उनके भ्रूण बाह्य विकास के रूप में प्रयोगों के इन प्रकार के कार्य करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है। वे (अभी भी लगभग 20 अपेक्षाकृत बड़े हैं के रूप में अपने बड़े आकार (व्यास में 1-1.5mm) microinjection और शल्य चिकित्सा हेरफेर को सरल और ब्लासटुला चरणों द्वारा कोशिकाओं की छवि के लिए आसान कर रहे हैं81;) भर में हूँ। Xenopus में overexpression पढ़ाई करने के लिए सरल कर रहे हैं: जल्दी भ्रूण में इंजेक्ट mRNA के विशेष कोशिकाओं को निशाना बनाया जा सकता है और कुशलता से अनुवाद किया है।
fluorescently टैग किया Wnt8a / Wnt11b-हा-EGFP निर्माणों pCS2 Wnt8a हा 13, pCS2 Wnt11b हा 14 और EGFP का उपयोग कर उत्पन्न किया गया। हा पेप्टाइड यह जीन उत्पादों दोनों कार्य करने की अनुमति Wnt और EGFP प्रोटीन को अलग करने के लिए एक स्पेसर के रूप में कार्य करने के लिए सोचा है, क्योंकि एक अतिरिक्त आणविक टैग प्रदान करते हैं, लेकिन यह भी करने के लिए ही नहीं है, को शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है। श्श्श के दृश्य के लिए प्रयोग किया जाता है का निर्माण पहले से एक श्श्श-EGFP संलयन प्रोटीन 15 व्यक्त एक ट्रांसजेनिक माउस उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; इस कृपया एंडी मैकमोहन द्वारा प्रदान किया गया। महत्वपूर्ण बात है, सभी निर्माणों के लिए GFP टैग यह प्रसंस्करण के बाद बनाए रखा है कि इस तरह के संकेत अनुक्रम करने के लिए '3 क्लोन है। यह अंतिम प्रोटीन संशोधन के लिए आवश्यक दृश्यों, ऐसे additio भी शामिल है कि यह सुनिश्चित करने के लिए भी जरूरी हैके रूप में लिपिड के एन सिंथेटिक mRNA का prodution के लिए अनुकूलित है जो pCS2 + अभिव्यक्ति वेक्टर में subcloned थे श्श्श और Wnt ligands.The cDNAs के लिए मामला है; यह एक SP6 प्रमोटर और polyadenylation संकेत (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors) भी शामिल है।
यहाँ वर्णित काम स्राव और fluorescently के प्रसार की तुलना के लिए एक सरल प्रोटोकॉल Wnt और श्श्श ligands टैग किया टैग किया है। सिंथेटिक mRNA का परिभाषित मात्रा में इंजेक्शन के द्वारा, प्रोटोकॉल अलग प्रमोटरों का उपयोग कर विभिन्न वैक्टर से चर अभिव्यक्ति के साथ जुड़े किसी भी समस्याओं circumnavigates। इन तरीकों में हाल ही में श्श्श-EGFP और Wnt8a / Xenopus 16-17 में Wnt11b-हा-EGFP स्राव और प्रसार पर heparan सल्फेट endosulfatase Sulf1 के प्रभाव की जांच करने के लिए लागू किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का एक अनिवार्य हिस्सा आम तौर पर, संसाधित स्रावित, और संलग्न एक फ्लोरोसेंट आधा भाग होने के बावजूद प्राप्त सेल में एक प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने में सक्षम हैं कि जैविक रूप से सक्रिय ligand…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एक बीबीएसआरसी द्वारा वित्त पोषित किया गया यह काम (बी बी / H010297 / 1), खोज एवं बचाव के लिए एक बीबीएसआरसी कोटा छात्रवृत्ति, और swf करने के लिए एक एमआरसी छात्रवृत्ति एमईपी को अनुदान।
Materials
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | N/A | N/A | Free download http://fiji.sc/Fiji |
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | N/A | http://www.photoshop.com/products |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer – M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | N/A | N/A | homemade |
| Zen lite software | Carl Zeiss | N/A | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
References
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. . FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics : A biologist’s guide. , (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).
