Bruke Confocal Analyse av<em> Xenopus laevis</em> For å undersøke modulatorer av Wnt og Shh Morphogen Gradienter
Summary
Manuskriptet her gir et enkelt sett med metoder for å analysere utskillelsen og spredning av fluorescently merkede ligander i Xenopus. Dette gir en sammenheng for å teste muligheten for andre proteiner for å modifisere ligand fordeling og tillater eksperimenter som kan gi innsikt i mekanismene som regulerer morphogen gradienter.
Abstract
Denne protokollen beskriver en metode for å visualisere ligander fordelt over et felt av celler. Det er utrolig lett å uttrykke eksogene proteiner, sammen med den store størrelsen på sine celler i tidlige embryoer, gjør Xenopus laevis en nyttig modell for å visualisere GFP-merket ligander. Syntetiske mRNA er effektivt settes etter injeksjon i tidlig stadium Xenopus embryo, og injeksjoner kan være rettet mot en enkelt celle. Når kombinert med en avstamning tracer, for eksempel membran bundet RFP, kan det injiserte cellen (og dens etterkommere) som gir de overuttrykt protein lett følges. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av fluorescensmerket WNT og shh ligander fra injisert mRNA. Fremgangsmåtene involverer micro disseksjon av ectodermal eksplantater (dyre caps) og analyse av ligand diffusjon i flere prøver. Ved å bruke confocal bildebehandling, kan informasjon om ligand sekresjon og spredning over et felt av celler oppnås. Statistiske analyser av konfokale bilder gir kvantitative data om formen ligand gradienter. Disse metodene kan være nyttig for forskere som ønsker å teste effekten av faktorer som kan regulere formen morphogen gradienter.
Introduction
Under tidlig embryoutvikling, blir cellene progressivt forpliktet til å følge bestemte linjer av differensiering: Dette betyr at en gruppe av totipotent (eller pluripotent) celler blir begrenset gradvis til å etablere populasjoner av stamceller bestemt for å gi opphav til en celletype. Celle-celle signalisering er sentralt i reguleringen av avstamning spesifikasjon under embryonal utvikling. Manipulering av disse signalene vil være nødvendig for å lede stamceller mot spesielle skjebner å støtte nye medisinske behandlinger.
Et relativt lite antall signalveier er gjentatt under utvikling, blant annet veier å svare på TGF super (nodals og BMP) 1-2, FGF'er 3, Wnts 4, og Pinnsvin 5. Disse utskilte proteiner binde reseptorer til stede på cellemembranen for å aktivere signaloverføring og dermed endre genekspresjon og / eller celle-adferd. Den stramme regulering av celle tegnAlling er viktig for celle avstamning spesifikasjon og normal utvikling. Mens krysstale mellom disse banene er viktig for å bestemme skjebnen celle, kan et enkelt ligand i seg selv fremkalle forskjellige responser i forskjellige konsentrasjoner. Morphogen gradienter ble beskrevet over 100 år siden som en teori for å forklare hvordan ulike celletyper kan utlede fra et felt av celler 6. Signale molekyler som produseres av en gruppe celler kan diffundere over et visst område, avtar i konsentrasjon med en større avstand fra kilden. Celler utsatt for signalet vil reagere på den lokale konsentrasjon i sine posisjoner i feltet av celler, med celler i forskjellige stillinger reagere forskjellig på forskjellige nivåer i signalet. Bevis for eksistensen av morphogens kommer fra studier av den tidlige Drosophila embryo 7 og vingen skive 8, i tillegg til virveldyr lem 9 og neural røret 10.
Metoder er nødvendig for å ivestigate hvordan morphogen gradienter er etablert og å identifisere andre molekyler viktige i å regulere disse stigninger. Elegante eksperimenter ved hjelp av immunhistokjemi for å visualisere endogene proteiner in vivo i forbindelse med ulike genetiske bakgrunn er blitt brukt til å undersøke morphogen gradienter 11-12. Imidlertid gode antistoffer og spesifikke mutanter er ikke alltid tilgjengelig, så vi beskriver her en protokoll ved hjelp av overekspresjon av fluorescerende ligander i Xenopus, for å tilveiebringe en alternativ, enkel metode for å dissekere hvor eksogene genprodukter kan påvirke fordelingen av ligander over et felt av celler. Xenopus laevis gir et utmerket system for å gjennomføre slike eksperimenter som sine embryoer utvikle eksternt, slik at de er tilgjengelige på de tidligste stadiene. Sin store størrelse (1-1.5mm i diameter) forenkler mikroinjeksjon og kirurgisk manipulering og ved blastula iscenesetter cellene er lett å image som de er fortsatt relativt stor (ca. 2081; m over). Overekspresjon studier i Xenopus er enkelt å gjøre: mRNA injiseres i tidlig embryo kan målrettes mot bestemte celler og er effektivt oversatt.
De fluorescently tagget Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP konstruksjoner ble generert ved hjelp pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 og EGFP. HA peptid er viktig å inkludere, ikke bare for å gi en ytterligere molekylær tag, men også fordi det er tenkt å fungere som en avstandsholder som skiller de WNT og EGFP-proteiner tillater begge genprodukter for å fungere. Den konstruksjon som brukes for visualisering av Shh ble tidligere brukt til å generere et transgene mus som uttrykker en Shh-EGFP-fusjonsprotein 15; dette ble vennlig levert av Andy McMahon. Viktigere er GFP tag for alle konstruksjonene klonet 3 'for signalsekvensen, slik at det opprettholdes etter behandlingen. Det er også viktig å sikre at det endelige protein omfatter sekvenser som er nødvendig for modifikasjoner, slik at tilsetningenn av lipider som er tilfelle for Shh og Wnt ligands.The cDNA ble subklonet i pCS2 + uttrykk vektor som er optimalisert for prodution av syntetisk mRNA; den inneholder en SP6 promoter og polyadenyleringssignalet (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
Arbeidet er beskrevet her gir en enkel protokoll for å sammenligne sekresjon og spredning av fluorescently tagget Wnt og Shh tagget ligander. Ved å injisere definerte mengder syntetiske mRNA, circumnavigates protokollen eventuelle problemer knyttet til variabel uttrykk fra ulike vektorer ved hjelp av ulike arrangører. Disse metodene har nylig blitt brukt for å undersøke effektene av heparansulfat endosulfatase Sulf1 på Shh-EGFP og Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP sekresjon og diffusjon i Xenopus 16-17.
Protocol
Representative Results
Discussion
En vesentlig del av denne protokollen er å generere biologisk aktive ligander som er normalt bearbeides, utskilte, og i stand til å fremkalle en reaksjon i mottakercellen, til tross for at en fluoriserende gruppe er festet. Det er viktig å fastslå at det fluorescens-merket genprodukt er biologisk aktivt ved hjelp av et passende assay. For Hysj-GFP, ble muligheten til å aktivere uttrykk for PTC1 bekreftet 16. Wnt8a har en bemerkelsesverdig potent evne til å indusere en sekundær akse når de utt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av en BBSRC innrømme MEP (BB / H010297 / 1), en BBSRC kvote studieplass til SAR, og en MRC studieplass til SWF.
Materials
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | N/A | N/A | Free download http://fiji.sc/Fiji |
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | N/A | http://www.photoshop.com/products |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer – M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | N/A | N/A | homemade |
| Zen lite software | Carl Zeiss | N/A | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
References
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. . FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics : A biologist’s guide. , (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).
