الرئة ورم الخلية تجنيد الإنزيم
Summary
ويصف هذه المخطوطة طريقة لقياس تراكم خلية ورم في الرئتين في نموذج حيوان من ورم خبيث.
Abstract
للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تحكم ورم خبيث، وقد اقترحت فحوصات مختلفة باستخدام الماوس كحيوان نموذج. هنا، علينا أن نظهر مقايسة بسيطة لتقييم التسرب خلية ورم أو ميكروميتاستاسيس. في هذا التحليل، تم حقن الخلايا السرطانية عن طريق الوريد الذيل، وبعد فترة قصيرة، تم تشريح الرئتين وهضمها لعد الخلايا الورم المسمى المتراكمة. هذا التحليل تخطي الخطوة الأولى في غزو الورم الرئيسي في الأوعية الدموية ويسهل دراسة الأحداث التي وقعت في الجهة البعيدة حيث يحدث ورم خبيث. عدد الخلايا التي تحقن في الأوعية الدموية يمكن أن يكون الأمثل لمراقبة عدد محدود من الانبثاث. وأفيد أن الخلايا اللحمية في الجهاز البعيد الذي يسهم في ورم خبيث. وهكذا، يمكن أن يكون هذا التحليل هو أداة مفيدة لاستكشاف الأدوية العلاجية المحتملة، أو أجهزة لمنع ورم خبيث.
Introduction
ورم خبيث حسابات لارتفاع معدل الوفيات في أمراض السرطان. ومن وجهة نظر التحقيقات على المستوى الجزيئي، ورم خبيث يمكن تقسيمها إلى خطوات متعددة: بدء الورم على موقع الورم الرئيسي، ونمو الورم الرئيسي والاجتياح المحيطة بالانسجة، إينترافاسيشن، والتداول عن طريق الأوعية الدموية ، التسرب على الأجهزة البعيدة، وإعادة نمو الورم. كل خطوة تنطوي على مجموعات مختلفة من إشارات الجزيئات/1.
تعني الدراسات حتى الآن بالأحداث التي تحدث في الأجهزة البعيدة قبل أن تبدأ الخلايا السرطانية تنتشر في الدم، والذي يعرف أيضا المرحلة ما قبل المنتشر2،3،4،5، 6. كشفت دراسات نموذجية الماوس لدينا أن ييسر مرحلة ما قبل المنتشر الرئة ورم خبيث بإنشاء استجابات التهابية طويلة الأمد وذات المستوى المنخفض في الرئتين. مرحلة ما قبل المنتشر يتميز هايبربيرميبيليتي ثيميكروفاسكولاتوري، وتجنيد خلايا نخاع العظام المشتقة (بمدك)، و upregulation من جزيئات سيتوكين/تشيموكيني-مثل بما في ذلك3،S100A8 و SAA34 . وقد أبلغ أوكسيديز lysyl أن يعدل المصفوفة خارج الخلية في الرئتين إلى تجنيد بمدكس7. وقد كشف تقرير آخر أهمية Angpt2 و MMP3 MMP10 في مرحلة ما قبل المنتشر8. وبعبارة أخرى، التفاعلات المعقدة بين الأورام الأولية ونخاع العظام والأجهزة البعيدة بحاجة إلى تفهم والتضمين بشكل صحيح (على سبيل المثال، باستخدام العقاقير التي تستهدف البروتينات المشاركة في هذه التفاعلات) لمنع ورم خبيث المستقبل9 . لتنظيم مرحلة ما قبل المنتشر، ينبغي أولاً أن تصور وتقييم تدخلات تشخيصية أو علاجية. هنا، نحن تقرير الرئة ورم توظيف خلية مقايسة التي تمكن هذه الدراسة مرحلة ما قبل المنتشر في الرئتين.
ورم الخلايا تحقن مباشرة في الأوعية الدموية للماوس مشابهة لتعميم خلايا الورم في مرضى السرطان، رغم أنه قد تكون هناك اختلافات بين الخلايا المزروعة وتعميم الخلايا السرطانية. تعميم خلايا الورم أنفسهم الخضوع لبعض التغييرات المميزة عند دخول الدورة الدموية من الورم الرئيسي. ومع ذلك، يمكن أن تشكل الخلايا المزروعة الأورام في الفئران العوز عند أنها يتم حقنها في الوريد الذيل. بالإضافة إلى ذلك، في النظام النموذجي الماوس، الأسفار المسماة الخلايا السرطانية يمكن استخدامها التي تسمح لتعقب هذه الخلايا في الجسم. سلوك الخلايا السرطانية بتعميم أمر بالغ الأهمية كما أنها تحدد النتائج في نهاية المطاف في مرضى السرطان10. الدم ليس مكاناً جيدا للبقاء على قيد الحياة من ورم الخلايا2. أنهم بحاجة للهروب من الهجوم عن طريق المضيف المناعي وتحتاج إلى إشارات apoptotic المضادة لمنع المبرمج بسبب الافتقار إلى الدعم المادي. توليد الخلايا السرطانية مع قدرات أعلى من بدء الورم في مواقع المنتشر أكثر ورم العقيدات. إذا كان إظهار الخلايا السرطانية انتحاء جهاز معين، ينبغي التقيد بورم خبيث في تلك الأجهزة معينة. في هذا التحليل، لا يتم تضمين الخطوات الأولية لتتالي المنتشر (نمو الورم الرئيسي والغزو)، وحتى يتم التركيز على التفاعل بين تعميم الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية (خلايا بطانية والخلايا الظهارية، وخلايا الدم). في فحوصات حقن خلية الورم التقليدية، الباحثين يجب أن تنتظر حتى ينمو الورم العقيدات لحجم ملموسة للكشف عن ورم خبيث. وفي هذه الحالة، لا يمكن تحديده كمياً العدد الدقيق للخلايا السرطانية في الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك، تتضمن هذه العملية مرحلة نمو ورم، مما يشير إلى أن عوامل أخرى في الخلايا السرطانية قد تؤثر على النتيجة.
عد تسمية الخلايا السرطانية تحت ستيريوميكروسكوبي fluorescence عملية بسيطة. ستيريوميكروسكوبي يوفر مجال رؤية واسع حيث يمكن تفحص الرئة كاملة. التدفق الخلوي هو أيضا أداة مفيدة أن يعطي على الفور دقة عدد الخلايا السرطانية في الأنسجة. عد الخلايا الفلورسنت في الأنسجة تحت مجهر [كنفوكل] من الممكن أيضا وعرض الصور الأكثر دقة لخلايا الورم المنتشر ولكن أنها تستغرق وقتاً طويلاً وقد تعطي نتائج متحيزة إلا إذا كان يتم احتساب مساحة محددة. والهدف النهائي لهذا التحليل مراقبة مدى سهولة تتراكم الخلايا السرطانية في الرئتين. كما ذكرت سابقا4من3،، في حالة الرئتين في المرحلة ما قبل المنتشر بسبب إشارات تحريضية من الورم الرئيسي، الورم حقن الخلايا المعرضة لتتراكم في الرئتين، مما يعني ضمناً فرص أكبر لورم خبيث في الرئة. قد تخفف من الشروط الأخرى (التهاب المفاصل، الربو، إلخ)، ومعاملتهم بالعوامل المضادة للالتهابات (مثل مكافحة-TNFα) ورم خبيث في الرئة. وهكذا نخلص إلى أن هذا التحليل أداة قوية لتقييم إمكانية الرئة ورم خبيث.
Protocol
Representative Results
Discussion
من الممكن معالجة مسبقة للفئران مع الأجسام المضادة، والأدوية، وحمية عالية الدهون أو مكيفة ورم المتوسطة قبل حقن الخلايا السرطانية. والخطوة الأكثر صعوبة في هذا التحليل هو حقن الوريد الذيل. نتائج الحقن غير مكتملة في البيانات غير حاسمة. على المنوال الذيل في C57BL/6 الصعوبة بمكان تحديد، أدى إلى فش…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لا شيء
Materials
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).
- Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis. Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).
- Deguchi, A., et al. Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner. Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Huang, Y., et al. Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis. Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).
- Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review. The Breast. 23, 552-560 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway. Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).
- Hiratsuka, S., et al. Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci. Nature Communications. 4, 1853 (2013).
- Deguchi, A., et al. Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment. Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).
- Ieguchi, K., et al. ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis. Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).
