Questo manoscritto descrive un metodo per quantificare l’accumulo di cellule del tumore nei polmoni in un modello animale della metastasi del tumore.
Per studiare i meccanismi molecolari che regolano la metastasi del tumore, sono stati proposti vari saggi usando il mouse come un animale di modello. Qui, dimostriamo un semplice test per valutare lo stravaso delle cellule di tumore o micrometastasi. In questa analisi, le cellule del tumore sono state iniettate attraverso la vena caudale, e dopo un breve periodo, i polmoni erano dissecati e digeriti per contare le cellule del tumore con etichetta accumulato. Questo test salta il passaggio iniziale dell’invasione del tumore primario nel vaso sanguigno e facilita lo studio di eventi in organi distanti dove si verifica la metastasi del tumore. Il numero di cellule iniettate nel vaso sanguigno può essere ottimizzato per osservare un numero limitato di metastasi. È stato segnalato che le cellule stromal in organi distanti contribuiscano alla metastasi. Così, questo test potrebbe essere uno strumento utile per esplorare il potenziale terapeutici farmaci o dispositivi per la prevenzione della metastasi del tumore.
Metastasi del tumore rappresenta alta mortalità nelle malattie legate al cancro. Dal punto di vista delle indagini a livello molecolare, metastasi può essere diviso in più fasi: l’inizio del tumore al luogo primario del tumore, la crescita del tumore primario e invasione nei circostanti tessuti, intravasation, circolazione attraverso i vasi sanguigni , lo stravaso in organi distanti e la ricrescita del tumore. Ogni fase prevede diversi insiemi di molecole/segnali1.
Gli studi fin qui sono stati interessati con eventi che si verificano in organi distanti, prima le cellule tumorali circolanti nel sangue, che è anche conosciuto come la fase pre-metastatico2,3,4,5, 6. I nostri studi di modello del mouse ha rivelato che la fase di pre-metastatica facilita la metastasi del polmone con la creazione di lunga durata e basso livello le risposte infiammatorie nei polmoni. La fase di pre-metastatica è caratterizzata da hyperpermeability di themicrovasculature, reclutamento di cellule di derivazione midollare (BMDC) e il upregulation di citochine/chemochine-come molecole tra cui S100A8 e SAA33,4 . È stato segnalato che lisil ossidasi consente di modificare la matrice extracellulare nei polmoni per reclutare BMDCs7. Un altro rapporto ha rivelato l’importanza della Angpt2, MMP3 e MMP10 nella fase pre-metastatico8. In altre parole, le intricate interazioni tra tumori primari, midollo osseo e organi remoti devono essere capito e correttamente modulata (ad esempio, utilizzando farmaci mirati proteine coinvolte in queste interazioni) per prevenire futura metastasi9 . Per regolare la fase di pre-metastatica, in primo luogo dovrebbe essere visualizzato e valutato per interventi diagnostici o terapeutici. Qui, segnaliamo un’analisi di reclutamento polmonare del tumore delle cellule che consente lo studio della fase pre-metastatico nei polmoni.
Le cellule del tumore iniettate direttamente nel vaso sanguigno del mouse sono simili a fare circolare le cellule del tumore in malati di cancro, anche se ci possono essere differenze tra cellule coltivate e cellule tumorali circolanti. Cellule tumorali circolanti stessi subire alcuni cambiamenti caratteristici quando entrano in circolazione dal tumore primario. Tuttavia, le cellule coltivate possono formare tumori in topi immunodeficienti quando vengono iniettati nella vena caudale. Inoltre, nel sistema modello del mouse, può essere utilizzato fluorescenza etichettato le cellule del tumore che consentono il rilevamento di queste cellule nel corpo. Il comportamento di cellule tumorali circolanti è critico che determinano le estreme conseguenze in cancro pazienti10. Sangue non è un buon posto per la sopravvivenza del tumore le cellule2. Hanno bisogno di fuggire da attacco da sistema immunitario dell’ospite e hanno bisogno di segnali anti-apoptotici per prevenire l’apoptosi dovuto una mancanza di supporto fisico. Le cellule del tumore con maggiore abilità dell’inizio del tumore ai siti metastatici generano più noduli del tumore. Se le cellule tumorali mostrano tropismo organo specifico, metastasi dovrebbe essere osservata in quegli organi particolari. In questa analisi, non sono inclusi i passaggi iniziali della cascata metastatica (crescita primaria del tumore e l’invasione), e così il focus è sull’interazione fra le cellule del tumore e le cellule stromali (cellule endoteliali, cellule epiteliali e le cellule del sangue) di circolazione. Nelle analisi di iniezione delle cellule del tumore convenzionali, i ricercatori devono attendere fino a quando i noduli del tumore crescono a una dimensione tangibile per rilevare la metastasi. In questo caso, il numero esatto delle cellule del tumore nel vaso sanguigno non può essere quantificato. Inoltre, questo processo include una fase di ricrescita del tumore, che indica che altri fattori nelle cellule del tumore possono influenzare il risultato.
Conteggio etichettato le cellule del tumore sotto un microscopio stereoscopico di fluorescenza è un processo semplice. Lo stereomicroscopio fornisce un ampio campo di vista in modo che l’intero polmone può essere scansionato. Citometria a flusso è anche un utile strumento che dà immediatamente un numero preciso di cellule del tumore nel tessuto. Contando le cellule fluorescenti nel tessuto sotto un microscopio confocale è anche possibile e visualizza le immagini più precise delle cellule del tumore metastatico, ma esso richiede tempo e può dare risultati parziale se solo un’area selezionata viene conteggiata. L’obiettivo finale di questo test è quello di osservare come facilmente le cellule del tumore si accumulano nei polmoni. Come riferito precedentemente3,4, se i polmoni sono in fase pre-metastatico a causa della segnalazione infiammatoria dal tumore primario, le cellule tumorali iniettate sono inclini ad accumularsi nei polmoni, così che implica una maggiore probabilità di metastasi del polmone. Altre condizioni (artrite reumatoide, asma, ecc.) e il loro trattamento con agenti anti-infiammatori (ad esempio anti-TNFα) può attenuare la metastasi del polmone. Quindi, possiamo concludere che questo test è un potente strumento per valutare la possibilità della metastasi del polmone.
Pre-trattamento dei topi con anticorpi, farmaci, una dieta ricca di grassi o medio del tumore-condizionato prima dell’iniezione delle cellule del tumore è possibile. Il passo più difficile in questo dosaggio è l’iniezione della vena della coda. Iniezione incompleta provoca dati inconcludenti. La vena della coda in C57BL/6 è particolarmente difficile da identificare, con conseguente iniezioni non riuscite. Ponendo i mouse su un rilievo di riscaldamento (° C 37) aiuta a dilata la vena di coda affinché iniezione diven…
The authors have nothing to disclose.
Nessuno
Collagenase | Sigma | C6885 | |
Dispase | Gibco | 17105-041 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |