Ensaio de recrutamento de células de Tumor de pulmão
Summary
Este manuscrito descreve um método para quantificar o acúmulo de células de tumor nos pulmões em um modelo animal de metástases de tumor.
Abstract
Para investigar os mecanismos moleculares que regem a metástase do tumor, foram propostos vários ensaios usando o mouse como um animal de modelo. Aqui, demonstramos um ensaio simples para avaliar o extravasamento de células de tumor ou micrometastasis. Neste ensaio, células tumorais foram injetadas na veia da cauda, e após um curto período, os pulmões foram dissecados e digeridos para contar as células de tumor rotulado acumulada. Este ensaio ignora o passo inicial da invasão do tumor primário para os vasos sanguíneos e facilita o estudo dos acontecimentos no órgão distante, onde ocorre a metástase do tumor. O número de células injetadas dentro do vaso sanguíneo pode ser otimizado para observar um número limitado de metástases. Relatou-se que as células do estroma no órgão distante contribuem para metástase. Assim, este ensaio poderia ser uma ferramenta útil para explorar o potenciais terapêuticas drogas ou dispositivos para prevenção de metástases de tumor.
Introduction
Metástase de tumor responsável por elevada mortalidade em doenças relacionadas ao câncer. Do ponto de vista das investigações a nível molecular, a metástase pode ser dividido em várias etapas: iniciação do tumor no local do tumor primário, o crescimento do tumor primário e invasão em vizinhas tecidos, intravasation, circulação através dos vasos sanguíneos , extravasamento em órgãos distantes e re-crescimento do tumor. Cada etapa envolve diferentes conjuntos de moléculas/sinais1.
Estudos até à data têm se preocupado com eventos que ocorrem em órgãos distantes, antes que as células do tumor começam circulando no sangue, o que também é conhecido como a fase pre-metastática2,3,4,5, 6. Nossos estudos de modelo de rato revelaram que a fase pré-metastática facilita a metástase do pulmão através da criação de longa duração e baixo nível de respostas inflamatórias nos pulmões. A fase pré-metastática é caracterizada por hyperpermeability de themicrovasculature, recrutamento de células derivada de medula óssea (BMDC) e upregulation das moléculas cytokine/chemokine-like, incluindo S100A8 e SAA33,4 . Tem sido relatado que lisil oxidase modifica a matriz extracelular nos pulmões para recrutar BMDCs7. Outro relatório revelou a importância da Angpt2, MMP3 e MMP10 na fase pre-metastática8. Em outras palavras, as intricadas interações entre tumores primários da medula óssea e órgãos remotos precisam ser entendido e corretamente modulada (por exemplo, usando drogas que proteínas envolvidas nessas interações de destino) para evitar futura metástase9 . Para regular a fase pré-metastática, deve primeiro ser visualizado e avaliado para intervenções de diagnósticos ou terapêuticas. Aqui, nós relatamos um ensaio de recrutamento de células do tumor pulmonar que permite o estudo da fase pré-metastático nos pulmões.
Células tumorais injetadas diretamente dentro do vaso sanguíneo do mouse são semelhantes aos circulam células tumorais em pacientes com câncer, embora possa haver diferenças entre culturas de células e células tumorais de circulação. Circulantes de células de tumor se se submeter a algumas mudanças características quando entram em circulação do tumor primário. No entanto, culturas de células podem formar tumores em camundongos imunodeficientes quando eles são injetados na veia da cauda. Além disso, no sistema modelo de rato, fluorescência rotulada células tumorais pode ser usada que permitem o acompanhamento destas células no corpo. O comportamento de células tumorais em circulação é fundamental ao determinar as consequências finais em pacientes de câncer10. Sangue não é um bom lugar para a sobrevivência de células de tumor2. Eles precisam escapar do ataque, o sistema imunológico do hospedeiro e precisar de anti-apoptotic sinais para prevenir apoptose devido a falta de suporte físico. Células tumorais com habilidades superiores de iniciação de tumor metastático locais geram mais nódulos de tumor. Se as células do tumor mostram tropismo de órgão específico, metástase deve ser observada nesses órgãos particulares. Neste ensaio, os passos iniciais da cascata metastática (invasão e crescimento do tumor primário) não estão incluídos e, portanto o foco na interação entre circulantes de células tumorais e as células do estroma (células endoteliais, células epiteliais e células do sangue). Em ensaios de injeção convencional tumor celular, pesquisadores precisa esperar até nódulos de tumor crescem para um tamanho de tangível para detectar metástase. Neste caso, não é possível quantificar o número exato de células tumorais no vaso sanguíneo. Além disso, este processo inclui uma fase de rebrota de tumor, indicando que outros fatores nas células de tumor podem afetar o resultado.
Contando rotulado células tumorais sob um microscópio de fluorescência é um processo simples. O microscópio estereoscópico fornece um amplo campo de visão, para que o pulmão inteiro pode ser digitalizado. Citometria de fluxo é também uma ferramenta útil que instantaneamente dá um número exato de células tumorais no tecido. Contar as células fluorescentes no tecido com um microscópio confocal é igualmente possível e exibe as imagens mais precisas das células do tumor metastático, mas é demorado e pode dar resultados tendenciosos se apenas uma área selecionada é contabilizada. O objetivo deste teste é observar como facilmente as células do tumor se acumular nos pulmões. Como relatado anteriormente3,4, se os pulmões estão em fase pré-metastático devido a sinalização inflamatória do tumor primário, as células do tumor injetado são propensas a se acumular nos pulmões, implicando, portanto, maiores chances de metástase pulmonar. Outras doenças (artrite reumatoide, asma, etc.) e o seu tratamento com agentes anti-inflamatórios (como o anti-TNFa) podem atenuar metástase pulmonar. Assim, podemos concluir que este ensaio é uma ferramenta poderosa para avaliar a possibilidade de metástase pulmonar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pré-tratamento de ratos com anticorpos, drogas, uma dieta high-fat ou tumor-condicionado médio antes da injeção de células de tumor é possível. O passo mais difícil neste ensaio é a injeção de veia de cauda. Injeção incompleta resulta em dados inconclusivos. A veia da cauda em C57BL/6 é particularmente difícil de identificar, resultando em falhadas injeções. Colocando o rato sobre uma almofada de aquecimento (37 ° C) ajuda a dilata a veia da cauda para que a injeção se torna mais fácil.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum
Materials
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
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