We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.
La detección de pequeñas concentraciones de moléculas hasta el límite de una sola molécula tiene impacto en áreas como la detección precoz de la enfermedad, y los estudios fundamentales sobre el comportamiento de las moléculas. Técnicas individuales de detección molécula comúnmente utilizan etiquetas como etiquetas fluorescentes o puntos cuánticos, sin embargo, las etiquetas no siempre están disponibles, aumentar el costo y la complejidad, y pueden perturbar los eventos están estudiando. Resonadores ópticos han surgido como un medio prometedor para detectar moléculas individuales sin el uso de etiquetas. Actualmente la partícula más pequeña detectada por un sistema resonador óptico no mejorada plasmonically desnudo en solución es un poliestireno esfera 25 nm 1. Hemos desarrollado una técnica conocida como frecuencia de bloqueo óptico Whispering Evanescent Resonador (FLOR) que puede superar este límite y lograr sola detección de moléculas de etiqueta libre en solución acuosa 2. Como fuerza de la señal escalas con el volumen de partículas, nuestro trabajo representa un> improveme 100xnt en la relación señal a ruido (SNR) sobre el estado actual de la técnica. Aquí los procedimientos detrás FLOR se presentan en un esfuerzo por aumentar su uso en el campo.
Experimentos de detección de moléculas individuales son útiles para reducir la cantidad de analito utilizado en biosensores, para la detección precoz de la enfermedad, y para examinar las propiedades fundamentales de moléculas 3. Tales experimentos se realizan normalmente usando etiquetas, sin embargo, las etiquetas no siempre son posibles de obtener para una proteína particular, aumentar el costo, puede perturbar los eventos están estudiando, y puede ser un inconveniente, sobre todo por el tiempo real en el sitio experimentos o punto-de- diagnósticos de atención.
El estándar de oro actual de biosensor libre de etiquetas es resonancia de plasmón superficial 4, sin embargo los sistemas comercial resonancia de plasmón superficial tienen típicamente un límite inferior de detección típica del orden de nM. Recientemente, resonadores ópticos han emergido como una tecnología prometedora para la etiqueta libre sola molécula biodetección 5. Resonadores ópticos trabajo basado en los de largo plazo (ns) confinamiento de la luz 6,7. La luz es evanescentejunto a estos dispositivos normalmente a través de una fibra óptica. Cuando la longitud de onda de la luz que pasa a través de la fibra coincide con la longitud de onda de resonancia del resonador, de manera eficiente la luz se acopla al resonador. Esta luz acoplada refleja totalmente internamente dentro de la cavidad del resonador generar un campo evanescente en la proximidad de la circunferencia del resonador. Como partículas entran en el campo evanescente y se unen al resonador, la longitud de onda de resonancia de los cambios de resonador en proporción al volumen de la partícula 8.
En términos de capacidad de detección, resonadores de microesferas anterior se han utilizado para detectar solo la influenza A partículas de virus (100 nM) 9,10. Recientemente, resonadores ópticos mejorada plasmonically en microesferas se han utilizado para detectar el suero de albúmina bovina sola moléculas de oligonucleótidos 11 y 8-mer 12, sin embargo, este enfoque limita el área de captura de partículas de 0,3 micras por 2 devicio. Grandes biosensores zona de captura son ideales para maximizar la posibilidad de detección de partículas. Las tecnologías actuales basados en soluciones de etiqueta libre de biosensores con grandes (> 100 m 2) zonas de captura se han limitado a la detección de partículas de poliestireno ≥ 25 nm.
Hemos desarrollado un sistema biosensor etiqueta gratuito basado en la tecnología resonador óptico conocido como Frecuencia Bloqueo óptico Whispering Evanescent Resonador (FLOR) 13 (Figura 1) que es capaz de detectar de resolución temporal de las moléculas individuales en solución. FLOR utiliza la larga vida útil de fotones de resonadores ópticos microtoroid combinados con una frecuencia de bloqueo de control de retroalimentación, detección equilibrada, y filtrado de cómputo para detectar partículas pequeñas a moléculas de proteínas individuales. El uso de la frecuencia de bloqueo permite que el sistema para rastrear siempre la resonancia desplazamiento de la microtoroid como partículas se unen, sin la necesidad de barrer o escanear la longitud de onda láser sobregrandes rangos. Los principios de la FLOR pueden utilizarse para mejorar las capacidades de detección de otras técnicas que incluyen la mejora plasmónica. En lo que sigue, se describen los procedimientos para realizar FLOR.
Como una partícula se une, la longitud de onda de resonancia (λ) del toroide aumenta. Si una partícula desenlaza, la longitud de onda de resonancia disminuye correspondientemente (un evento de bajada). El diámetro de partícula (d) se puede determinar a través de histogramas de la amplitud de cada paso de longitud de onda. La altura de cada paso de longitud de onda varía debido a las variaciones de tamaño de la partícula atado y debido a la ubicación en la microtoroid donde la partícula se un…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported in part by a National Research Service Award (T32GM07616) from the National Institute of General Medical Sciences.
Tunable diode laser | Newport | TLB-6300 |
Laser controller | Newport | TLB-6300-LN |
Frequency locking feedback controller | Toptica Photonics | Digilock 110 |
Auto-balanced photoreceiver | Newport | Model 2007 |
In-line polarization controller | General Photonics | PLC-003-S-90 |
24-bit data acquisition card | National Instruments | NI-PCI-4461 |
Recombinant human interleukin-2 | Pierce Biotechnology | R201520 |
20 nm polystyrene beads | Thermo Scientific | 3020A |
NanoCube XYZ Piezo Stage | Physik Instrumente | P-611.3 |
Optical table | Newport | VH3660W-OPT |
Objective lens for imaging column | Navitar Machine Vision | 1-60228 |
Imaging column (adaptor tube) | Navitar Machine Vision | 1-60228 |
High-Res CCD camera for imaging column | Edmund Industrial Optics | NT39244 |