Summary

Differentiatie van de SH-SY5Y Human Neuroblastoom Cell Line

Published: February 17, 2016
doi:

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

De mogelijkheid om te gebruiken in vitro model systeem is sterk verbeterd op het gebied van neurobiologie en de neurowetenschappen. Cellen in cultuur zorgen voor een efficiënt platform om eiwitten functionaliteit en moleculaire mechanismen van specifieke verschijnselen te karakteriseren, aan de pathologie van de ziekte en infecties te begrijpen, en de voorlopige drugstests evaluaties uit te voeren. In neurobiologie, de belangrijkste soorten van celcultuur modellen omvatten primaire neuronale culturen afkomstig van ratten en muizen, en neuroblastoma cellijnen zoals ratten B35 cellen 5, Neuro-2A muizencellen 6, en ratten PC12 cellen 7. Hoewel het gebruik van dergelijke cellijnen het veld is aanzienlijke vooruitgang geboekt, zijn er verschillende verstorende factoren die samenhangen met de behandeling van niet-menselijke cellen en weefsels. Deze omvatten begrip soort-specifieke verschillen in metabole processen fenotypen van ziekten manifestatie en pathogenese in vergelijking met mensen. Het is ook belangrijk om op te merken dat dere bestaan ​​aanzienlijke verschillen tussen muis en genexpressie van de mens en transcriptiefactor signalering, aandacht voor de beperkingen van diermodellen en het belang van inzicht in welke trajecten worden geconserveerd tussen knaagdieren en mensen 8-11. Anderen hebben het gebruik van menselijke neuronale cellijnen met inbegrip van de N-Tera-2 (NT2) humane teratocarcinoom cellijn en induceerbare pluripotente stamcellen (iPSCs) toegepast. Deze cellijnen leveren goede modellen in vitro menselijke systemen. Echter, differentiatie NT2 cellen met retinoïnezuur (RA) resulteert in de vorming van een gemengde populatie van neuronen, astrocyten en gliacellen radiale 12, noodzakelijk een extra zuiveringsstap zuivere populaties van neuronen te verkrijgen. Bovendien NT2 cellen vertonen een zeer variabele karyotype 13, met meer dan 60 chromosomen in 72% van de cellen. iPSCs tonen variabiliteit in differentiatie tussen verschillende cellijnen en variëren in differentiatie efficiency 14. Het is daarom wenselijk om een consistente en reproduceerbare menselijke neuronale cellen bij deze alternatieven aanvulling hebben.

SH-SY5Y neuroblast-achtige cellen zijn een subkloon van de ouderlijke neuroblastoma cellijn SK-N-SH. De ouderlijke cellijn werd gegenereerd in 1970 uit een beenmergpunctie dat zowel neuroblast-achtige en epitheliale-achtige cellen 15 bevat. SH-SY5Y cellen een stabiele karyotype bestaande uit 47 chromosomen, en kan worden onderscheiden van een neuroblast-achtige toestand tot volgroeide menselijke neuronen door een aantal verschillende mechanismen waaronder het gebruik van RA, forbolesters, en specifieke neurotrofinen zoals hersen- afgeleide neurotrofe factor (BDNF). Voorgeschiedenis suggereert dat het gebruik van verschillende methoden kan kiezen voor een specifieke neuron subtypen zoals adrenergische, cholinerge en dopaminerge neuronen 16,17. Dit laatste maakt SH-SY5Y cellen bruikbaar voor een veelheid aan neurobiologie experimenten.

NHOUD "> Verschillende studies hebben belangrijke verschillen tussen de SH-SY5Y cellen in hun ongedifferentieerde en gedifferentieerde Staten genoteerd. Bij SH-SY5Y cellen ongedifferentieerd, ze zich snel vermenigvuldigen en lijken niet-gepolariseerde, met zeer weinig, korte processen te zijn. Ze groeien vaak in groepjes en expressie merkers indicatief onvolwassen neuronen 18,19. bij gedifferentieerde, deze cellen verlengen lange, vertakte processen afname in proliferatie, en in sommige gevallen polariseren 2,18. volledig gedifferentieerde SH-SY5Y cellen zijn eerder aangetoond dat een drukken verscheidenheid van de verschillende markers van volwassen neuronen waaronder groei geassocieerd eiwit (GAP-43), neuronale kernen (Neun), synaptophysine (SYN), synaptischeblaasjeseiwit II (SV2), neuron specifieke enolase (NSE) en de microtubule-geassocieerde eiwit (MAP) 2,16,17,20, en de expressie van gliale merkers zoals gliacellen fibrillaire zuur eiwit (GFAP) 4 ontbreekt. In verdere ondersteuning die gedifferentieerde SH-SY5Y cellen VERTEGEnt een homogene neuronale populatie, verwijdering van BDNF resulteert in cellulaire apoptose 4. Dit suggereert dat de overleving van gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen is afhankelijk van trofische factoren, vergelijkbaar neuronen rijpen.

Gebruik van SH-SY5Y cellen is sinds de subkloon werd in 1978 3. Voorbeelden van hun toepassing omvatten onderzoeken ziekte van Parkinson 17, de ziekte van Alzheimer 21 en de pathogenese van virale infectie, waaronder poliovirus 22, enterovirus 71 (EV71) 23,24 , varicella-zoster virus (VZV) 1, humaan cytomegalovirus 25, en herpes simplex virus (HSV) 2,26. Het is belangrijk op te merken dat verschillende studies met SH-SY5Y cellen zijn deze cellen in hun ongedifferentieerde vorm, met name op het gebied van Neurovirology 27-36. Het verschil in de waargenomen fenotype van ongedifferentieerde versus gedifferentieerde SH-SY5Y cellen roept de vraag op whether de waargenomen progressie van de infectie zou anders in de volwassen gedifferentieerde neuronen zijn. Bijvoorbeeld gedifferentieerde SH-SY5Y cellen een hogere efficiëntie van HSV-1 opname versus ongedifferentieerde, prolifererende SH-SY5Y-cellen, die kunnen worden veroorzaakt door een gebrek aan oppervlaktereceptoren die HSV binden moduleren notitie gedifferentieerde SH-SY5Y cellen 2. Het is daarom van groot belang dat bij het ​​ontwerpen van een experiment gericht op het testen van neuronen in vitro moeten SH-SY5Y-cellen worden gedifferentieerd om de meest nauwkeurige resultaten te vertalen en vergelijking met in vivo modellen te verkrijgen.

De ontwikkeling van een betrouwbare methode voor de menselijke neuronale culturen genereren noodzakelijk om onderzoekers translationele experimenten die het menselijk zenuwstelsel nauwkeurig modelleren voeren. Het protocol hier gepresenteerde is een procedure die 'best practices' afgeleid van de vorige methoden 1-4 bakent te verrijken voor menselijke neuronen die worden onderscheidengebruik retinoïnezuur.

Protocol

1. Algemene overwegingen Zie de tabel van Materialen / Apparatuur voor een lijst van noodzakelijke reagentia. Voer alle stappen onder strikte aseptische omstandigheden. Gebruik warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (hiFBS) voor alle media voorbereidingen die FBS bevatten. Aan hitte-geïnactiveerd, warm een 50 ml aliquot van FBS bij 56 ° C gedurende 30 min, omkeren elke 10 minuten (zie ook tabel 1). Opmerking: Als FBS wor…

Representative Results

Momenteel zijn er veel gevallen op het gebied van neurobiologie en Neurovirology waarbij gedifferentieerde SH-SY5Y cellen als een functioneel model voor humane neuronen 27-36, en belangrijker nog, ongedifferentieerde cellen missen fenotypes worden gebruikt, zoals virale optimale opname 2 die noodzakelijk voor nauwkeurige interpretatie. Het is essentieel dat bij gebruik van SH-SY5Y cellen of andere in vitro neuronale systeem, cellen gedifferentieerde in neuronen, om gegevens die de best mog…

Discussion

Het bovenstaande protocol voorziet in een eenvoudige en reproduceerbare methode om homogene en levensvatbare menselijke neuronale culturen te genereren. Dit protocol maakt gebruik van technieken en praktijken die een aantal eerder gepubliceerde werkwijzen 1-4 en doelstellingen te integreren om de best practices van elkaar af te bakenen. Differentiatie van SH-SY5Y cellen berust op een geleidelijke serum deprivatie; de toevoeging van retinoïnezuur, neurotrofe factoren en extracellulaire matrixeiwitten; en seri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).

Materials

B-27 Invitrogen 17504-044 See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Sigma SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug) See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) Sigma D0627 See Table 1 for preparation
DMSO ATCC 4-X
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) Sigma M5650
Fetal Bovine Serum (FBS)  Hyclone SH30071.03 See Table 1 for preparation
GlutamaxI Life Technologies 35050-061
Glutamine Hyclone SH30034.01
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-1 See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution Sigma E0282 See step 11 of the protocol
Neurobasal Life Technologies 21103-049
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Life Technologies 15140-122
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells ATCC CRL-2266
0.5% Trypsin + EDTA Life Technologies 15400-054
Falcon 35mm TC dishes Falcon (A Corning Brand) 353001

References

  1. Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
  2. Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
  3. Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
  4. Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
  5. Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
  8. Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
  9. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  10. Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
  11. Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
  12. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
  13. Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
  14. Hu, B. -. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  15. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  16. Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
  17. Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  18. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
  19. Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
  20. Cheung, Y. -. T., Lau, W. K. -. W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
  21. Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer’s disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
  22. La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
  23. Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
  24. Xu, L. -. J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
  25. Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
  26. Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
  27. Yun, S. -. I., Song, B. -. H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
  28. Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
  29. Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
  30. Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
  31. Xu, K., Liu, X. -. N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
  32. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
  33. Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
  34. Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
  35. Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
  36. Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
  37. Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
  38. Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
  39. Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).

Play Video

Cite This Article
Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line. J. Vis. Exp. (108), e53193, doi:10.3791/53193 (2016).

View Video