Differensiering av SH-SY5Y human cellelinje Neuroblastom

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

Muligheten til å bruke in vitro modellsystemer har kraftig forbedret innen nevrobiologi og nevrovitenskap. Celler i kultur gi en effektiv plattform for å karakterisere protein funksjon og molekylære mekanismer bak konkrete fenomener, for å forstå patologi av sykdom og smitte, og for å utføre foreløpige narkotika testing vurderinger. I nevrobiologi, de store typer cellekultur modeller inkluderer primære nevronale kulturer som stammer fra rotter og mus, og neuroblastom cellelinjer som rotte B35 celler ^5, Neuro-2A museceller ⁶ og rotte PC12 celler ^7. Selv om bruken av slike cellelinjer har avansert feltet betydelig, er det flere forstyrrende faktorer i forbindelse med håndtering av ikke-humane celler og vev. Disse inkluderer forståelse artsspesifikke forskjeller i stoffskiftet, fenotyper av sykdom manifestasjon, og patogenesen i forhold til mennesker. Det er også viktig å merke seg atre er betydelige forskjeller mellom mus og menneske genekspresjon og transkripsjonsfaktor signalering, fremhever begrensningene i gnagermodeller og viktigheten av å forstå hvilke veier er konservert mellom gnagere og mennesker ^8-11. Andre har anvendt anvendelse av humane nervecellelinjer, inkludert N-Tera-2 (NT2) humant teratocarcinom cellelinje og induserbare pluripotente stamceller (iPSCs). Disse cellelinjene gi gode modeller for in vitro menneskelige systemer. Imidlertid differensiering av celler med NT2-retinsyre (RA) resulterer i genereringen av en blandet populasjon av neuroner, astrocytter, og radiale gliaceller ^12, som nødvendiggjør et ytterligere rensetrinn for å oppnå rene populasjoner av neuroner. I tillegg NT2 celler demonstrere en svært variabel karyotype ^13, med mer enn 60 kromosomer i 72% av cellene. iPSCs demonstrere variasjon i differensiering mellom ulike cellelinjer og varierer i differensiering effektivitet ^14. Det er derfor ønskelig å ha en konsekvent og reproduserbar humane, neuronale cellemodell for å komplettere disse alternativene.

SH-SY5Y neuroblast lignende celler er en subklon av foreldre neuroblastom cellelinje SK-N-SH. Den foreldrecellelinjen ble generert i 1970 fra en benmargsbiopsi som inneholder både neuroblast-aktig og epitelceller-lignende celler ^15. SH-SY5Y celler har en stabil karyotype bestående av 47 kromosomer, og kan skilles fra en neuroblast aktig tilstand til modne humane nerveceller ved en rekke forskjellige mekanismer, inkludert bruk av RA, forbolestere, og spesifikke neurotrofiner som hjerne-avledet neurotrophic factor (BDNF). Tidligere bevis tyder på at bruk av forskjellige metoder kan selektere for spesifikke neuron undertyper så som adrenerge, kolinerge, og dopaminerge neuroner ^16,17. Dette siste aspektet gjør SH-SY5Y celler nyttige for en rekke neurobiology eksperimenter.

ontent "> Flere studier har notert viktige forskjeller mellom SH-SY5Y-celler i deres udifferensierte og differensierte tilstander. Når SH-SY5Y celler er udifferensierte de raskt spre seg og ser ut til å være ikke-polarisert, med svært få, korte prosesser. De ofte vokse i klumper og uttrykke markører som indikerer umodne nevroner ^18,19. Når differensiert, disse cellene strekker lange, forgrenede prosesser, reduksjon i proliferasjon, og i noen tilfeller polarisere ^2,18. fullt differensierte SH-SY5Y-celler har tidligere blitt vist å uttrykke en rekke ulike markører for modne nevroner inkludert vekst-assosiert protein (GAP-43), nevrale kjerner (Neun), synaptophysin (SYN), synaptisk vesikkelproteinet II (SV2), nervecellen enolase (NSE) og microtubule assosiert protein (MAP) ^2,16,17,20, og å mangle uttrykk for glial markører som glial fibrillary surt protein (GFAP) ^4. i ytterligere støtte som differensiert SH-SY5Y celler represent en homogen neuronal populasjon, fjerning av BDNF resulterer i cellulær apoptose ^4. Dette tyder på at overlevelse av differensierte SH SY5Y-celler er avhengig av trofiske faktorer, i likhet med modne neuroner.

Bruk av SH-SY5Y-celler har økt siden subklon ble etablert i 1978 ^3. Noen eksempler på deres anvendelse omfatter undersøke Parkinsons sykdom ^17, Alzheimers sykdom ^21, og patogenesen av viral infeksjon, inkludert poliovirus ^22, enterovirus 71 (EV71) ^23,24 , varicella-zoster virus (VZV) ^1, human cytomegalovirus ^25, og herpes simplex virus (HSV) ^2,26. Det er viktig å merke seg at flere studier ved bruk av SH-SY5Y-celler har brukt disse cellene i deres udifferensierte form, spesielt når det gjelder neurovirology ^27-36. Forskjellen i den observerte fenotype av udifferensiert versus differensierte SH-SY5Y celler reiser spørsmålet om whether den observerte utviklingen av infeksjon ville være annerledes i modne differensierte nevroner. For eksempel, differensierte SH-SY5Y celler har en høyere effektivitet av HSV-1 opptak versus udifferensierte, prolifererende SH-SY5Y celler, som kan være på grunn av mangel på overflatereseptorer som binder HSV og modulerer oppføring på udifferensierte SH-SY5Y celler ^2. Det er derfor viktig at ved utformingen av et eksperiment rettet mot testing av nerveceller in vitro, burde SH-SY5Y-celler differensieres for å oppnå de mest nøyaktige resultater for oversettelse og sammenlignet med in vivo-modeller.

Utviklingen av en pålitelig metode for å generere menneskelige nevrale kulturer er viktig å gi forskerne utføre translasjonsforskning eksperimenter som nøyaktig modellere menneskelige nervesystemet. Protokollen som presenteres her er en prosedyre som avtegner beste praksis som stammer fra tidligere metoder ^1-4 for å berike for menneske nevroner som skiller segved hjelp av retinsyre.

Protocol

1. Generelle hensyn Se tabell for material / Utstyr for en liste over nødvendige reagenser. Utfør alle trinnene under strenge aseptiske forhold. Bruk varme-inaktivert føtalt bovint serum (HIFBS) for alle papir preparater som inneholder FBS. For å varme-inaktiverer, oppvarmes en 50 ml alikvot av FBS ved 56 ° C i 30 min, å invertere hvert 10 min (se også tabell 1). Merk: Når FBS anvendes uten varme-inaktivering, utvikler den epiteliale-…

Representative Results

I dag er det mange tilfeller innen nevrobiologi og neurovirology hvor udifferensierte SH-SY5Y celler blir brukt som en funksjonell modell for menneske nevroner 27-36, og viktigst, udifferensierte celler kan mangle fenotyper som optimal viral opptak 2 som er nødvendig for nøyaktig tolkning. Det er viktig at når man bruker SH-SY5Y-celler eller andre in vitro-nervesystemet, blir cellene hensiktsmessig differensiert til neuroner, for å oppnå data som er best mulig representasjon av hva so…

Discussion

Ovennevnte protokollen gir en enkel og reproduserbar metode for å generere homogene og levedyktige menneskelige nevrale kulturer. Denne protokollen benytter teknikker og praksis som integrerer flere tidligere publiserte metoder ^{1-4 og} tar sikte på å avgrense beste praksis i hver. Differensiering av SH-SY5Y celler er avhengig av gradvis serum deprivasjon; tilsetning av retinsyre, neurotrofiske faktorer og ekstracellulære matriseproteiner; og serie splitting å velge for differensierte modne tilhenger nevro…

Materials

B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	–
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	–
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	–
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	–
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	–
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	–
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	–
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	–