Differentiering av SH-SY5Y humana neuroblastom cellinje

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

Möjligheten att använda i modell vitro-system har förbättrats avsevärt inom neurobiologi och neurovetenskap. Celler i odling ger en effektiv plattform för att karaktärisera proteiner fungerar och molekylära mekanismerna bakom specifika fenomen, att förstå patologin av sjukdomar och infektioner, samt att utföra preliminära bedömningar drogtestning. I neurobiologi, de vanligaste typerna av cellodlingsmodeller innefattar primära neuronala kulturer härledda från råttor och möss och neuroblastomcellinjer såsom råtta B35 celler ^5, Neuro-2A musceller ^{6 och} råtta PC12-celler ^7. Även om användningen av sådana cellinjer har avancerat fältet avsevärt, finns det flera påverkande faktorer som är förknippade med hantering av icke-humana celler och vävnader. Dessa inkluderar förståelse artspecifika skillnader i metaboliska processer, fenotyper sjukdoms manifestation, och patogenes jämfört med människor. Det är också viktigt att notera attre finns betydande skillnader mellan mus och människa genuttryck och transkriptionsfaktor signalering, belyser begränsningarna i gnagarmodeller och vikten av att förstå vilka vägar är konserverade mellan gnagare och människa ^8-11. Andra har använt användning av mänskliga neuronala cellinjer, inklusive N-Tera-2 (NT2) human teratokarcinom cellinje och inducerbara pluripotenta stamceller (iPSCs). Dessa cellinjer ger goda modeller för mänskliga system in vitro. Men för att differentiering av NT2-celler med retinsyra (RA) resulterar i alstringen av en blandad population av neuroner, astrocyter, och radiella gliaceller ^12, som nödvändiggör ett ytterligare reningssteg erhålla rena populationer av neuroner. Dessutom, NT2-celler uppvisar en mycket varierande karyotyp ^13, med större än 60 kromosomer i 72% av celler. iPSCs visar variationen i differentiering mellan olika cellinjer och varierar i differentiering effektivitet ^14. Det är därför önskvärt att ha en konsekvent och reproducerbar human neuronal cellmodell för att komplettera dessa alternativ.

SH-SY5Y-neuroblast-liknande celler är en subklon av den parentala neuroblastomcellinje SK-N-SH. Modercellinjen genererades på 1970 från en benmärgsbiopsi som innehåller både neuroblast-liknande och epiteliala-liknande celler ^15. SH-SY5Y-celler har en stabil karyotyp består av 47 kromosomer, och kan skiljas från en neuroblast liknande tillstånd till mogna mänskliga nervceller genom en mängd olika mekanismer, inklusive användningen av RA, forbolestrar och specifika neurotrofiner såsom hjärna härrörande neurotrofisk faktor (BDNF). Dessförinnan tyder på att användningen av olika metoder kan välja för specifika neurontyper såsom adrenerga, kolinerga och dopaminerga neuroner ^16,17. Den sistnämnda aspekten gör SH-SY5Y-celler är användbara för en mängd olika neurobiology experiment.

INNEHÅLL "> Flera studier har noterat viktiga skillnader mellan SH-SY5Y-celler i sina odifferentierade och differentierade tillstånd. När SH-SY5Y-celler är odifferentierade, de snabbt föröka sig och verkar vara icke-polariserad, med mycket få, korta processer. De växer ofta i klumpar och uttrycker markörer som tyder på omogna nervceller ^18,19. När differentierade dessa celler förlänger långa, förgrenade processer, minskad spridning, och i vissa fall polarisera ^2,18. Helt differentierade SH-SY5Y-celler har tidigare visat att uttrycka en mängd olika markörer för mogna neuroner inklusive tillväxt associerat protein (GAP-43), neuronala kärnor (Neun), synaptophysin (SYN), synaptiska vesikelproteinet II (SV2), neuronspecifikt enolas (NSE) och mikrotubuli associerat protein (MAP) ^2,16,17,20 och sakna uttryck av gliaceller markörer såsom glia fibrillärt surt protein (GFAP) ^4. i ytterligare stöd för att differentierade SH-SY5Y-celler represent en homogen neuronal population, avlägsnande av BDNF resulterar i cellulär apoptos ^4. Detta tyder på att överlevnaden av differentierade SH-SY5Y-celler är beroende av trofiska faktorer, som liknar mogna nervceller.

Användning av SH-SY5Y-celler har ökat sedan subklonen grundades 1978 ^3. Några exempel på deras användning inkluderar undersöker Parkinsons sjukdom ^17, Alzheimers sjukdom ²¹ och patogenesen av virusinfektion inkluderande poliovirus ^22, enterovirus 71 (EV71) ^23,24 , varicella zoster-virus (VZV) ^1, humant cytomegalovirus ^25, och herpes simplex-virus (HSV) ^2,26. Det är viktigt att notera att flera studier med hjälp av SH-SY5Y-celler har använt dessa celler i sin odifferentierade form, särskilt när det gäller neurovirology ^27-36. Skillnaden i den observerade fenotypen av odifferentierade kontra differentierade SH-SY5Y-celler väcker frågan om whether den observerade utvecklingen av infektion skulle vara annorlunda i mogna differentierade neuroner. Till exempel differentierade SH-SY5Y-celler har en högre effektivitet av HSV-1 upptag kontra odifferentierade, förökar SH-SY5Y-celler, som kan bero på bristande ytreceptorer som binder HSV och modulerar post i odifferentierade SH-SY5Y-celler ^2. Det är därför viktigt att när man utformar ett experiment fokuserade på att testa neuroner in vitro, bör SH-SY5Y-celler differentieras i syfte att erhålla de mest exakta resultat för översättning och jämförelse med in vivo-modeller.

Utvecklingen av en tillförlitlig metod för att generera humana neuronala kulturer är absolut nödvändigt att göra det möjligt för forskare att utföra translationella experiment som noggrant modellera människans nervsystem. Protokollet presenteras här är ett förfarande som avgränsar bästa praxis som härrör från tidigare metoder ^1-4 för att anrika för mänskliga nervceller som är differentierademed användning av retinsyra.

Protocol

1. Allmänna överväganden Se Tabell över Material / Utrustning för en lista över nödvändiga reagens. Utför alla steg under strikt aseptiska förhållanden. Använda värmeinaktiverat fetalt bovint serum (hiFBS) för alla mediaberedningar som innehåller FBS. För att värma-inaktivt, värma en 50 ml alikvot av FBS vid 56 ° C under 30 min, inverterande varje 10 min (se även tabell 1). Obs: När FBS används utan värmeinaktivering, f…

Representative Results

För närvarande finns det många instanser inom neurobiologi och neurovirology där odifferentierade SH-SY5Y celler används som en funktionell modell för mänskliga nervceller 27-36, och viktigare, kan odifferentierade celler saknar fenotyper såsom optimal viral upptag 2 som är nödvändig för korrekt tolkning. Det är viktigt att när man använder SH-SY5Y-celler eller någon annan in vitro neuronala systemet, celler lämpligt differentieras till neuroner, i syfte att få fram data …

Discussion

Det ovanstående protokollet ger en enkel och reproducerbar metod för att generera homogena och livskraftiga mänskliga neuronala kulturer. Detta protokoll använder tekniker och metoder som integrerar flera tidigare publicerade metoder ^1-4 och syftar till att beskriva bästa praxis för varje. Differentieringen av SH-SY5Y celler förlitar sig på gradvis serumbrist; tillsatsen av retinsyra, neurotrofiska faktorer och extracellulära matrisproteiner; och serie uppdelning för att selektera för differentiera…

Materials

B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	–
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	–
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	–
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	–
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	–
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	–
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	–
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	–