使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視<em>ガウ</em>ルシフェラーゼSERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
小胞体（ER）は、細胞質のレベルよりも約5,000倍高い濃度で細胞内カルシウムの最高レベルを、含まれています。 ERカルシウムを厳格にコントロールは、タンパク質の折り畳み、修正や人身売買のために不可欠です。 ERカルシウムの摂動は、小胞体ストレス応答、三つ又のERストレス応答機構の活性化をもたらす、および種々の疾患で病因に寄与することができます。疾患の発症と進行の間に、ERカルシウムの変化を監視する能力は、実際にはまだ挑戦的、原理的には重要です。現在、このようなカルシウム依存性蛍光色素やタンパク質などERカルシウムを監視するための利用可能な方法は、細胞内の小胞体のカルシウム動態への洞察を提供してきたが、これらのツールは、in vivoでの研究のためにはあまり適していません。私たちの研究室では、 ガウシアルシフェラーゼのカルボキシ末端への変更は、に応じて、レポーターの分泌を与えることを実証しました小胞体カルシウム枯渇。 インビトロ及びインビボ用途においてルシフェラーゼベースの分泌ERカルシウム監視タンパク質（SERCaMP）を使用するための方法は、本明細書中に記載されています。このビデオでは、ERカルシウムの長手方向の監視のために肝臓の注射、GLUC-SERCaMP、血液収集および処理の薬理学的操作、およびアッセイパラメータを強調しています。
Introduction
タンパク質の折り畳み、タンパク質分泌、脂質ホメオスタシス、および1の細胞内シグナル伝達を含む多くの細胞容量の小胞体（ER）機能。通常のER機能の中心は〜5000倍細胞質2-4に見られるもので、管腔のカルシウム濃度を維持しています。このエネルギー集約的なプロセスはsarco /小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）、ERへのカルシウムイオンを移動させるポンプによって調整されます。 ERからのカルシウムの流出は、主としてリアノジン（のRyR）およびイノシトール三リン酸（IP3R）受容体によって媒介されます。多くのERプロセスは、カルシウムに依存しているので、店を中断すると、小胞体ストレスと最終的に細胞死につながることができます。
ERのカルシウム調節不全は、心筋症、糖尿病、アルツハイマー病、およびパーキンソン病を含む5において観察されています。これらの疾患の進行性の性質のために、それは因果再描写するために挑戦されています小胞体カルシウムストアの病因および変更の間lationship。多くの技術は、染料および遺伝的にコードされたカルシウム指標（GECIs）を含む、ERカルシウム動態の理解における大きな進歩のために許可されています。 Ca 2+と結合すると蛍光の増加低親和性のカルシウム色素は、カルシウム6の高濃度の細胞内コンパートメントを調べるために、細胞内にロードすることができます。このようD1ERと捕手としてGECIs、細胞内局在7-9のより正確な制御とカルシウムの変動の監視を可能にします。最近、GECIsの別のクラスは、カルシウム測定オルガネラ封入タンパク質指標（CEPIA）は10に記載されていると呼ばれます。遺伝学とエステル系カルシウム色素11（ERに標的化）遺伝的にコードされたカルボキシルエステラーゼを利用する小分子の化学的性質を標的エステラーゼされる色素充填（TED）を組み合わせた第三のアプローチ。
aforながらementionedアプローチは彼らが蛍光の急性測定によって、ERカルシウム動態に貴重な洞察を提供することができ、固有の長所と短所を持っています。これらは、しかしながら、多くの場合、疾患の進行を調査するために必要な縦断的研究のために最適ではありません。長時間にわたりカルシウム動態を監視するための方法を考案することを目的として、我々は、タンパク質（SERCaMPs）12を監視し 、分泌小胞体カルシウムを作成するために、タンパク質修飾を特定し、開発しました。
SERCaMPを繰り返し、ERカルシウムストアを調べるために低侵襲的アプローチを提供することによって、他の方法に関連したいくつかの制限を回避します。我々は以前に、カルボキシ末端ペプチドASARTDL（アラニン、セリン、アラニン、アルギニン、トレオニン – アスパラギン酸 – ロイシン）がER保持を促進するのに十分であることを実証しました。しかしながら、ERカルシウムの減少を引き起こす条件下で、ペプチド配列は、もはやER localizatioを保持することができませんnと、タンパク質が13分泌されます。 SERCaMP技術の基礎は、分泌タンパク質のカルボキシ末端の分泌は、このように、ERのカルシウム調節不全12の強固なレポーターを作成し、小胞体カルシウム枯渇によってトリガーされるように（例えば、 ガウシアルシフェラーゼ 、またはGLUC）にASARTDLの付属物です。トランスジェニック方法によるGLUC-SERCaMPの発現は、ERカルシウム恒常性の指標としてGLUC活性の変化について分析される細胞培養培地および血漿などの生体液を可能にします。この方法は 、インビトロおよびインビボの両方のERカルシウムストアの進行変化の縦断的研究のための用途を有します。以下のプロトコルは、ERカルシウム恒常性を研究するためにGLUCベースSERCaMPを使用するための一般的なアウトラインとして書かれているが、このプロトコルは、代替レポーターSERCaMPsためのガイドとして機能することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは 、インビトロを強調し、GLUC-SERCaMPの生体ユーティリティで、ERカルシウムの枯渇をモニターします。 SERCaMPを生成するタンパク質修飾は、他のレポータータンパク質12に一般に見えますが、我々は他のルシフェラーゼ18と比較して（200〜1,000倍以上）の強固な生物発光のためのガウシアルシフェラーゼを選択しました。私たちは、初?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
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