Övervakning endoplasmanätet kalciumhomeostas med hjälp av en<em> Gaussia</em> Luciferas SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
Endoplasmanätet (ER) innehåller den högsta nivån av intracellulärt kalcium, med koncentrationer ungefär 5000 gånger högre än cytoplasma nivåer. Strikt kontroll över ER kalcium är viktigt för proteinveckning, modifiering och människohandel. Störningar till ER kalcium kan resultera i aktivering av den ovikta proteinsvar, en tre-punkts ER stressrespons mekanism, och bidra till patogenes i en mängd olika sjukdomar. Förmågan att övervaka ER kalcium förändringar under sjukdoms uppkomsten och utvecklingen är principiellt viktigt, men utmanande i praktiken. För närvarande tillgängliga metoder för att övervaka ER kalcium, såsom kalciumberoende fluorescerande färgämnen och proteiner, har gett insikt i ER kalcium dynamik i celler, men dessa verktyg är inte väl lämpade för in vivo-studier. Vårt laboratorium har visat att en ändring till karboxiterminalen av Gaussia luciferas ger utsöndring av reportern som svar påER kalcium utarmning. Metoderna för användning av en luciferas baserad, utsöndrade ER kalcium övervakningsprotein (SERCaMP) för in vitro och in vivo applikationer beskrivs häri. Denna video belyser lever injektioner, farmakologisk manipulation av Gluc-SERCaMP, insamling och bearbetning av blod, och analysparametrar för längsgående övervakning av ER kalcium.
Introduction
Endoplasmanätet (ER) fungerar i många cellulära kapacitet, inklusive proteinveckning, proteinutsöndring, lipidhomeostas och intracellulära signal 1. Centralt för normal ER funktion är att upprätthålla luminala kalciumkoncentrationer vid ~ 5000 gånger högre än de som finns i cytoplasman 2-4. Denna energikrävande process regleras av Sarco / endoplasmatiska retiklet kalcium ATPas (SERCA), en pump som rör sig kalciumjoner in i ER. Utflödet av kalcium från ER förmedlas främst av ryanodin (Ryr) och inositoltrifosfat (IP3R) receptorer. Eftersom många ER processer är beroende av kalcium, kan störa affären leda till ER stress och slutligen celldöd.
ER kalcium dysreglering har observerats vid sjukdomar inklusive kardiomyopati, diabetes, Alzheimers och Parkinsons 5. På grund av den progressiva karaktären av dessa sjukdomar, har det varit en utmaning att beskriva orsak-verkan relation mellan patogenes och förändringar i ER kalcium butiken. Ett antal tekniker har gjort det möjligt för betydande framsteg i vår förståelse av ER kalcium dynamik, inklusive färger och genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs). Låg affinitet kalcium färgämnen, som ökar i fluorescens när de är bundna till Ca2 +, kan laddas in i celler för att undersöka subcellulära fack med höga koncentrationer av kalcium 6. GECIs, såsom D1ER och stopparen tillåter att kontrollera kalcium fluktuationer med mer exakt kontroll av subcellulär lokalisering 7-9. Nyligen, en annan klass av GECIs kallade kalciummätningsorganell-infångade proteinindikatorer (CEPIA) har beskrivits 10. En tredje strategi som kombinerar genetik och liten molekyl kemi är riktade-esteras färgämne lastning (TED), som utnyttjar en genetiskt kodad karboxylesteras (riktad mot ER) med en esterbaserad kalcium färgämne 11.
Medan AFORementioned tillvägagångssätt har inneboende styrkor och svagheter, de kan ge värdefull insikt i ER kalcium dynamik genom akuta mätningar av fluorescens. De är emellertid inte optimal för de longitudinella studierna ofta som krävs för att undersöka sjukdomsprogression. Med målet att ta fram en metod för att övervaka kalcium dynamik över långa tidsperioder, vi identifierat och tagit fram en proteinmodifiering för att skapa de utsöndrade ER kalcium övervaknings proteiner (SERCaMPs) 12.
SERCaMP kringgår flera begränsningar som är förknippade med andra metoder, genom att tillhandahålla en minimalt invasiv metod för att upprepade gånger avfråga ER kalcium butiken. Vi har tidigare visat att den karboxiterminala peptiden ASARTDL (alanin-serin-alanin-arginin-treonin-asparaginsyra-leucin) är tillräcklig för att befrämja kvarhållande i ER; dock under förhållanden som orsakar minskningar i ER kalcium, är inte längre kunna behålla ER localizatio peptidsekvensenn och proteinet utsöndras 13. Grunden för SERCaMP teknik är bihang ASARTDL till karboxiterminalen av ett utsöndrat protein (t.ex. Gaussia luciferas, eller gluk) så att utsöndring utlöses av ER kalcium utarmning, vilket skapar en robust reporter av ER kalcium dysreglering 12. Expressionen av Gluc-SERCaMP via transgena metoder möjliggör biologiska vätskor inklusive cellodlingsmedium och plasma som skall analyseras med avseende på förändringar i Gluc aktivitet som en indikator av ER kalciumhomeostas. Metoden har ansökningar om longitudinell studie av progressiva förändringar i ER kalcium butiken både in vitro och in vivo. Följande protokoll är skriven som en allmän översikt för att använda Gluc-baserade SERCaMP att studera ER kalciumhomeostas, men protokollet kan tjäna som vägledning för alternativa reporter SERCaMPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll belyser in vitro och in vivo-användbarheten av Gluc-SERCaMP att övervaka utarmning av ER kalcium. Även om proteinmodifiering för att generera SERCaMP tycks generalisera till andra reporter proteiner 12, valde vi Gaussia luciferas för sin robusta (200-1000 gånger högre) mareld jämfört med andra luciferaser 18. Vi visar detekterbara tapsigargin-inducerad Gluc-SERCaMP frisättning över en 100-faldigt dosintervall av Gluc-SERCaMP viruset levereras till primä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
- Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
- Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
- Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
- Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
- Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
- Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
- Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
- Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
- Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
- Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
- Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
- Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).
