Overvåking endoplasmic nettet kalsiumhomeostase Ved hjelp av en<em> Gaussia</em> Luciferase SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
Det endoplasmatiske retikulum (ER) inneholder det høyeste nivået av intracellulært kalsium, ved konsentrasjoner omtrent 5000 ganger større enn cytoplasmatiske nivåer. Stram kontroll over ER kalsium er viktig for proteinfolding, modifikasjon og trafficking. Perturbasjoner til ER kalsium kan resultere i aktivering av den ufoldede protein respons, en tre-spiss ER stress svar mekanisme, og bidrar til patogenese i en rekke sykdommer. Evnen til å overvåke ER kalsium forandringer i løpet av sykdomsutbruddet og progresjon er viktig i prinsippet, men likevel vanskelig i praksis. For tiden tilgjengelige metoder for overvåking ER kalsium, for eksempel kalsium-avhengige fluorescerende fargestoffer og proteiner, har gitt innsikt i ER kalsium dynamikken i cellene, men disse verktøyene er ikke godt egnet for in vivo studier. Vårt laboratorium har vist at en modifikasjon av den karboksy-terminale ende av Gaussia luciferase confers sekresjon av reporter i respons tilER kalsium uttømming. Metodene for anvendelse av en luciferase basert, utskilte ER kalsium overvåkning protein (SERCaMP) for in vitro og in vivo anvendelser er beskrevet heri. Denne videoen fremhever lever injeksjoner, farmakologisk manipulering av Gluc-SERCaMP, blod innsamling og prosessering, og analyseparametere for langsgående overvåking av ER kalsium.
Introduction
Endoplasmatisk retikulum (ER) fungerer på mange cellulære kapasiteter, inkludert proteinfolding, protein sekresjon, lipid homeostase, og intracellulær signale en. Sentralt i normal ER funksjon er å opprettholde luminale kalsiumkonsentrasjoner på ~ 5000 ganger de funnet i cytoplasma 2-4. Denne energikrevende prosess er regulert av Sarco / endoplasmatiske retikulum kalsium ATPase (SERCA), en pumpe som flytter kalsiumioner inn på akuttmottaket. Utstrømming av kalsium fra ER medieres primært av ryanodine (RyR) og inositol trifosfat (IP3R) reseptorer. Fordi mange ER prosesser er avhengige av kalsium, kan forstyrre butikken føre til ER stress og eventuell celledød.
ER kalsium dysregulation har blitt observert i sykdommer inkludert kardiomyopati, diabetes, Alzheimers og Parkinsons 5. På grunn av den progressive karakter av disse sykdommene er det blitt vanskelig å avgrense årsak-virkning relationship mellom patogenesen og endringer i ER kalsium butikken. En rekke teknologier har tillatt for betydelige fremskritt i vår forståelse av ER kalsium dynamikk, inkludert fargestoffer og genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs). Lavaffinitets kalsiumfargestoffer, som øker i fluorescens når de er bundet til Ca 2+, kan lastes inn i celler for å undersøke subcellulære lommer med høy konsentrasjon av kalsium 6. GECIs, slik som D1ER og Catcher tillate overvåkning av kalsium svingninger med mer presis styring av subcellulære lokalisering 7-9. Nylig, en annen klasse av GECIs kalles kalsium-måling organelle-omsluttet protein indikatorer (CEPIA) har blitt beskrevet 10. En tredje metode som kombinerer genetikk og lite molekyl kjemi er rettet-esterase fargestoff laste (TED), som benytter en genetisk kodet karboksylesterase (målrettet til ER) med en ester-basert kalsium fargestoff 11.
Mens aforementioned tilnærminger har iboende styrker og svakheter, de kan gi verdifull innsikt i ER kalsium dynamikk gjennom akutte målinger av fluorescens. De er imidlertid ikke optimal for de langsgående studier ofte nødvendig å undersøke sykdomsprogresjon. Med mål om å utarbeide en metode for å overvåke kalsium dynamikk over lengre tid, har vi identifisert og utviklet et protein modifikasjon for å lage de skilles ER kalsium overvåkings proteiner (SERCaMPs) 12.
SERCaMP omgår flere begrensninger forbundet med andre metoder, ved å gi en minimal invasiv tilnærming til gjentatte ganger avhøre ER kalsium butikken. Vi har tidligere demonstrert at den karboksy-terminale peptid ASARTDL (alanin-serin-alanin-arginin-treonin-aspartinsyre-leucin) er tilstrekkelig til å fremme ER retensjon; imidlertid, under betingelser som fører til reduksjon i ER kalsium, er peptidsekvensen ikke lenger i stand til å beholde ER localization og proteinet blir utskilt 13. Grunnlaget for SERCaMP teknologi er vedheng av ASARTDL til den karboksy-terminale ende av et utskilt protein (f.eks Gaussia luciferase, eller Gluc), slik at sekresjon utløses av ER kalsiummangel, og dermed skape en robust reporter av ER kalsium dysregulering 12. Ekspresjon av Gluc-SERCaMP via transgene metoder gjør det mulig for biologiske væsker, inkludert cellekulturmedium og plasma som skal analyseres for endringer i Gluc aktivitet som en indikator på ER kalsium homeostase. Fremgangsmåten har anvendelser for den langsgående studium av progressive endringer i ER kalsium butikken både in vitro og in vivo. Følgende protokoll er skrevet som en generell oversikt for bruk Gluc baserte SERCaMP å studere ER kalsiumhomeostase, men protokollen kan fungere som en guide for alternative reporter SERCaMPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen fremhever in vitro og in vivo nytten av Gluc-SERCaMP å overvåke utarming av ER kalsium. Selv om protein modifikasjon til å generere SERCaMP ser ut til å generalisere til andre reporter proteiner 12, valgte vi Gaussia luciferase for sin robuste (200-1000 ganger større) Bioluminescens sammenlignet med andre luciferases 18. Vi viser påvisbar thapsigargin-indusert Gluc-SERCaMP frigivelse over en 100-ganger doseområdet Gluc-SERCaMP virus levert til pri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
References
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
- Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
- Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
- Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
- Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
- Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
- Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
- Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
- Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
- Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
- Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
- Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
- Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).
