Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo
Summary
Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.
Abstract
Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples.
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as α-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.
Introduction
A acumulação intracelular de tau amilóides define tauopatias, tais como a doença de Alzheimer. Nas fases iniciais da doença, patologia está geralmente localizada em regiões discretas do cérebro, mas com a progressão da doença, patologia invariavelmente se espalha ao longo de redes neuronais distintas 1-5. Evidências sugerem propagação transcelular de agregados de proteínas tóxicas subjacente a esta patologia (revisto em 10/06). Neste modelo, sementes proteopathic (por exemplo, tau) são libertados a partir de células do doador e entrar nas células vizinhas, transformando proteína tau nativo na forma mal dobrada através modelada alteração conformacional 11-15. O ensaio aqui descrito foi desenvolvido para detectar com sensibilidade tal actividade semeadura. É compatível com a proteína recombinante e amostras biológicas e permite a quantificação dos níveis de actividade de semeadura proteopathic 16 minutos.
Células HEK 293T que expressam estavelmente tau d repetiçãoOMain (RD) contendo a mutação P301S associado à doença, quer fundido a PCP ou YFP (daqui em diante referido como células tau-RD-PCP / YFP) servir como um biossensor estável de actividade semeadura. Na ausência de sementes proteopathic, as células manter tau como um monómero solúvel em água, e não têm fundo apreciável de FRET. Absorção espontânea ou transdução mediada por lipossomas de sementes de tau para células, no entanto, resulta em RD-PCP e agregação RD-YFP, que produz um sinal de FRET, que é medida no interior das células individuais através de citometria de fluxo.
Numerosos componentes deste ensaio foram modificadas para aumentar a sensibilidade e reduzir a variabilidade. Uma linha celular monoclonal com uma proporção de 1: expressão RD-PCP / YFP 1 foi seleccionado, uma vez que proporciona melhor sinal: ruído. Para aumentar a sensibilidade, fosfolípidos são usados para introduzir sementes directamente em células (embora para estudar os mecanismos biológicos de captação, esta pode ser omitida). Finalmente, citometria de fluxo monitores FRET ao nível da população e uma única célula nível, ao contrário de outros ensaios de agregação de proteínas. A medida do resultado final, a densidade de FRET integrado, é altamente quantitativa e contabilidade, tanto para o número de células com a agregação, e do grau de agregação que ocorreu dentro de cada célula. Todos estes parâmetros optimizados aumentar a sensibilidade e garantir a reprodutibilidade.
Este sistema foi recentemente empregado em um estudo abrangente em camundongos transgênicos tauopathy P301S 17 que avaliou o aparecimento temporal e progressão da atividade sementeira tau em relação a outros marcadores patológicos de tau utilizada (por exemplo, MC1, AT8, PG5 e ThioflavinS). Sementeira actividade é, de longe, o marcador mais antigo e mais robusta de patologia tau avaliada, precedendo a detecção histológica por pelo menos 6 semanas. Atividade Sementeira aparece em 1.5 meses e aumenta progressivamente com a idade, sugerindo um papel causal de sementes proteopathic no início e / ou progressão da neurodegeneração 16.
e_content "> quantificação precisa dos níveis de material de semente de amostras biológicas hora pode facilitar estudos que monitoram a progressão da doença mais cedo. Ao encurtar a duração julgamento e permitindo o uso de animais mais jovens, isto poderia aumentar a eficiência ea precisão de testes em animais pré-clínicos. Por exemplo, em a P301S rato previamente descrito, os compostos de chumbo pode ser entregue tão cedo quanto 4-6 semanas (imediatamente antes, ou no início da actividade sementeira), e monitorizados quanto à eficácia de 2-4 semanas mais tarde. O ensaio deve quantificar com precisão quaisquer reduções de semeadura actividade. FRET citometria de fluxo tem aplicações in vitro de rastreio bem. Por exemplo, reagentes anti-tau (por exemplo, anticorpos, moléculas pequenas, etc.) pode ser rapidamente testado para a sua capacidade para bloquear a indução sementeira directamente em cultura, utilizando quer a tau recombinante agregados ou lisados derivado do cérebro como uma fonte de sementes (Figura 5). Com esta configuração, quando o material de semente é preparada, um experiment leva apenas três dias para ser concluída, incluindo a análise de dados. A rápida quantificação da actividade de semeadura proteopathic pode, assim, facilitar muitos estudos de neurodegeneração.Protocol
Representative Results
Discussion
A citometria de fluxo sistema FRET aqui descrito é uma ferramenta poderosa para a rápida e quantitativamente avaliar a atividade tau semeadura. Ela exige apenas a experiência de cultura celular moderada e um conhecimento prático de FRET e citometria de fluxo. Outros ensaios de semeadura, como Tioflavina T – que exibe fluorescência aumentada quando obrigado a estrutura de folha beta – são trabalhosos e requerem um substrato de proteína pura, recombinante. Além disso, os ensaios in vitro de semeadura para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).
Materials
| TBS | Sigma | T5912 |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 |
| 15 mL conical tube | USA Scientific | 1475-0501 |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 |
| 1.5 mL tubes | USA Scientific | 1615-5510 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| 50 mL Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 |
| 25 mL reagent resevoirs | VWR | 41428-954 |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | |
| 20 uL pipet tips | Rainin | GPS-L10 |
| 200 uL pipet tips | Rainin | GPS-250 |
| 1 mL pipet tips | Rainin | GPS-1000 |
| 200 uL pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 |
| 5 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 |
| 10 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 |
| 25 mL Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
References
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