小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法<em>熱帯熱マラリア原虫</em

Summary

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Abstract

鎌状赤血球対立遺伝子（HBS）を担当する遺伝的変異は 、P、マラリア原虫による感染に抵抗するために赤血球を可能にします熱帯熱マラリア原虫 。多因子性であることが知られており、この抵抗の分子的基礎は、完全には理解されたままです。最近の研究では、遺伝子調節や寄生虫の成長の両方に影響を与え、一度マラリア原虫に転位、赤血球マイクロRNAの発現差異ことがわかりました。これらのmiRNAは、後寄生虫mRNAの控えめなサブセットと5 'RNAの融合を介してキメラRNA転写物を形成することによりmRNAの翻訳を阻害することが示されました。ここで、技術はPの遺伝子調節および翻訳可能性に赤血球マイクロRNAの基礎となる機能的役割と推定されるメカニズムを研究するために使用されたこと熱帯熱マラリア原虫 、宿主赤血球に変性合成マイクロRNAのトランスフェクションを含め、詳細に説明します。最後に、ポリソーム勾配法は、TRAの程度を決定するために使用されますこれらの転写物のnslation。一緒に、これらの技術は、私たちは赤血球マイクロRNAの調節不全のレベルは鎌状赤血球の細胞固有のマラリア耐性に寄与することを実証することができました。

Introduction

属マラリア原虫のアピコンプレクサ寄生虫によって引き起こされるマラリアは、世界的に毎年約200万人が感染し、約60万死亡^{1を引き起こし} 、最も一般的な人間の寄生虫疾患です。ヒトに感染するマラリア原虫 5 種のうち、ヒトの疾患に最も関連があるP.熱帯熱マラリア原虫と P.彼らの広範囲の分布および重症マラリアの合併症の可能性のために三日熱マラリア原虫 、。マラリア原虫のライフサイクルは蚊と人間の両方の感染を必要とします。感染した蚊が人間をかむときに、寄生虫は複製の最初のラウンドが発生し、肝臓への血流を通って移動します。ホスト肝細胞からのメロゾイトが破裂した後、彼らは無性や性的いずれかの複製を開始し、近くの赤血球に感染します。 Pに 48時間持続する複製の無性段階、それはほとんどの発作の原因でもあるので、 熱帯熱マラリア原虫は 、この研究の焦点でありますアリアの症状とは、簡単に、in vitroで再現されています。

改善された抗マラリア治療を含む公衆衛生の取り組みの数は、多少グローバルマラリアの負担を低減しているが、薬剤耐性寄生虫の継続的な出現は、マラリア対策への取り組みのための問題を提起します。新しい治療法を提案することができる1つの領域は、遺伝的変異がマラリアに対する耐性を付与する方法、各種の研究です。マラリア流行地域では、赤血球の多型の様々な^2,3非常に一般的です。これらの変異は、鎌状赤血球は、おそらく最も顕著であることと、多くの場合、症候性マラリア感染⁴の発症に対する実質的な抵抗と関連しています。これらはマラリア感染に抵抗するために、赤血球を引き起こすことにより、基礎となるメカニズムは完全には理解されています。ヘモグロビン変異を有する寄生赤血球は、強化された細胞の剛性との脱水反応によってどの強化食作用の対象となりますP.減少侵入に関連しています熱帯熱マラリア原虫 ^5。 HBCアレルまた、寄生虫の開発^6,7を阻害 、赤血球表面および細胞骨格のリモデリングにタンパク質の発現に影響を与えます。最後に、P。熱帯熱マラリア原虫は、（HBSS）ホモ接合鎌内不十分成長マラリア耐性の固有赤血球要因を示唆し、in vitroで ^8,9を赤血球。これらのメカニズムのすべてが役割を果たしているように見えるがしかし、それらは完全にマラリアに鎌状赤血球性の背後にあるメカニズムを説明していません。

よくわかっていないまま赤血球要因の一つの潜在的なセットは、成熟赤血球内に存在するmiRNAの大きなプールです。マイクロRNAは、3 'UTR内の塩基対形成による翻訳および/または標的mRNAの安定性を仲介するサイズの小さな非コードRNA、19-25 ntのです。それらは、抑制Oを含む、哺乳動物の免疫応答の制御に関与していますFウイルス複製^10、及び植物中で、ウイルスに対する抵抗性を付与することが示されたが、それらはまた、赤血球^11,12と鉄代謝¹³を含むいくつかの赤血球のプロセスを調節することが示されています。以前の研究では、表情劇的HBSS赤血球^14,15に変更された赤血球のmiRNAの豊富で多様な集団を同定しました。成熟赤血球が活性転写および翻訳を欠いているので、これらの赤血球のmiRNAの機能的役割は不明なままです。重要な物質交換は、宿主細胞との間で発生するようにP.赤血球内発育サイクル^（IDC）16時の熱帯熱マラリア原虫は 、それがのHBs赤血球内の変更されたmiRNAプロファイルは、直接細胞固有のマラリア耐性に寄与する可能性があることが推測されました。

これらの研究は、最終的には、単離し同定および機能m以内のヒトmiRNAの役割を研究するためにパイプラインの開発につながっalaria寄生虫、P。これらのホスト/ヒトmiRNAは、最終的に共有結合ヒューズ、その後翻訳寄生虫mRNA転写物^{17を抑制する}ことが示された熱帯熱マラリア原虫 、。これは、トランススプライシングにより形成された第1の交差種のキメラ転写物の例を提供し、このmiRNAをmRNAの融合は、他の寄生虫を含む他の種で発生することができることを含意します。すべてのトリパノソーマmRNAはポリシストロン性転写物¹⁸の分離を調節するためにスプライスリーダー（SL）とトランス-スプライスされています。 P.ので、 熱帯熱マラリア原虫は、ダイサー/アゴー^19,20のためのオルソログを欠いている、それは赤血球のmiRNAがPに類似したSLの機械をハイジャックすることが可能です熱帯熱マラリア原虫は、標的遺伝子に統合します。 P.における最近の研究熱帯熱マラリア原虫は、実際には 5 'スプライスリーダー配列²¹の存在を示しています。本研究では、トランスクリプトームとtranslaの両方を含む、人間の寄生虫のmiRNAのmRNA融合転写物の発見につながった方法を詳述的な制御技術。これらの方法の全体的な目標は、Pの遺伝子調節、表現型と翻訳電位の低分子RNAの効果を調査するためにあります熱帯熱マラリア原虫の転写産物。

人間寄生虫キメラ転写物の最初の同定は、リアルタイムPCR、トランスクリプトーム配列決定およびESTライブラリ合計と小の両方のRNAを含まキャプチャ、だけではなく、小さなRNAを単離した技術を使用してのようなRNA解析技術の利用に依存。むしろ別々にするよりも、一つの大きなプールで一緒にすべてのRNAを単離する、より大きな配列の一部として、寄生虫の両方に転位し、人間の小さなRNAだけでなく、これらの小さなRNA配列の存在の同定を可能にしました。これは、これら融合体の機能的結果を決定するために、これらの融合mRNAの翻訳状態の分析を必要としました。

寄生虫のゲノムANの特性に関する広範な取り組みながらDのトランスクリプトームは、はるかに少ないPのライフサイクル全体でのmRNAトランスクリプトームの翻訳調節についてはほとんど知られていない、寄生虫の生物学^22-25の理解に追加しました熱帯熱マラリア原虫 ^26。寄生虫のプロテオームのこの限られた理解は寄生虫の生物学の理解と抗マラリア治療薬の次の世代のための新たな標的を同定する能力の両方を妨げてきました。寄生虫の細胞生物学の理解のこのギャップは 、Pの並進規制を調査するために十分な技術の不足によるところが大きい続いています熱帯熱マラリア原虫 。一つの最近の論文ではPのリボソームフットプリントを使用することを記載して熱帯熱マラリア原虫は、グローバル翻訳ステータス^{21を決定します} 。転写物の翻訳可能性の1つのよく確立された測定値は、ポリソームプロファイリングによって決定関連するリボソームの数です。しかし、この技術は、Pに印加されたとき熱帯熱マラリア原虫</ em>の、それはほとんどのポリソームを回復することができず、主にモノソームをキャプチャします。最近、いくつかのグループ^27,28は、P を最適化しましたポリソームを維持し、ホスト赤血球²⁸での無性開発中にこれらのマラリア原虫のリボソーム占有および翻訳可能性を特徴づけるために、同時に赤血球および寄生虫を溶解することにより熱帯熱マラリア原虫ポリソーム技術。

まとめると、これらの方法は、ヒトmiRNAおよび寄生虫mRNAの観察された融合が以前に報告された方法^{27を使用して実証された}ものを融合するmRNAの寄生虫タンパク質翻訳を調節する、およびHBAでマラリア抵抗性の主要な決定要因であるとHBSSは¹⁷赤血球ことを示しています。これらのメソッドは、それらの融合RNAは、P内にあるかどうかを識別し、機能的RNAスプライシング事象を探求しようとして任意のシステムにおいて有用であろう熱帯熱マラリア原虫または他の真核生物系。

Protocol

1：Pから小型RNAの単離IDCの間に熱帯熱マラリア原虫 無性文化29にマラリア原虫を取得します。 注：必要な培養サイズは、所望の用途に基づいて変化します。しかし、3〜5％の寄生虫血と5％のヘマトクリットで10ミリリットルの文化は、リアルタイムPCR（RT-PCR）のための十分なRNAを提供します。技術は当初、非同期の文化のために最適化されたが、感染サイク?…

Representative Results

P.中のヒトマイクロRNAのグローバルプロファイリング熱帯熱マラリア原虫 ここに提示された技術は、様々な条件に寄生虫からマイクロRNAを抽出するために使用されました。もう一つ注意すべきは、多くの場合、この記事を最初の研究29の双方に提示マイクロRNAデータの基準点を務め32に示すように、非感染赤血球のためのRNA抽出を行ったとい…

Discussion

HbSを、それがPによって引き起こされる重症マラリアに対する保護を提供する主な理由、マラリア流行地域で最も一般的なヘモグロビン変異体の一つであります熱帯熱マラリア原虫 。 P.の遺伝子調節におけるヒトマイクロRNAの役割を特徴づけるために必要な技術熱帯熱マラリア原虫は、この原稿全体に詳述されています。すべての低分子RNAを含むような方法で総RNA?…

Materials

REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.

Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758)

DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)

Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher)

Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad)

0.2 cm Electroporation cuvettes

4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700)

2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527)

1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545)

1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000)

100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626)

10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021)

10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750)

Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698)

Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04)

RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)

RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV)

10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039)

Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060))

HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)

45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)

1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)

1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)

Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)

Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)

Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)

mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).

5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)

Biotin powder (Sigma-Aldrich)

1M Potassium Chloride

Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)

Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)

Lysis buffer (see REAGENT SETUP)

15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)

60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)

Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)

RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)

RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)

REAGENT SETUP

Solutions

Plasmodium cell culture media

500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine

0.5 ml gentamicin

5 ml HT supplement

2.5 ml 45% glucose

25 ml 10% AlbuMAX I

12.5 ml 1 M HEPES

Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.

Plasmodium cell culture media containing 10x CHX

Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:

2 mM cycloheximide

Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.

1x PBS containing cycloheximide

Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.

Ribosome resuspension buffer

400 mM potassium acetate

25 mM potassium HEPES, pH 7.2

15 mM magnesium acetate

200 mM cycloheximide (add fresh)

1 mM DTT (add fresh)

1 mM PMSF (add fresh)

40 U/ml RNaseOUT (add fresh)

Lysis buffer

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:

1% (v/v) Igepal CA-630

0.5% (w/v) DOC

Sucrose solutions

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:

15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution

50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution

0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion

As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.

The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components

60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution

RNA Capture Wash Buffer

20mM  KCl

5unit/ml Rnase Out (Invitrogen)

RNA Capture Elution Buffer

Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:

2mM Biotin

EQUIPMENT

SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)

SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)

Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)

Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)

L8-80M ultracentrifuge (Beckman)

Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378)

1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)

5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)

Parafilm

Tube rotator, end-over-end

Microcentrifuge, refrigerated

Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)

TracerDAQ (Measurement Computing)

Eppendorf 5810R centrifuge

Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)