Количественное толстой стволовых клеток мутации
Summary
We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.
Abstract
Возможность измерения стволовых клеток мутации является мощным инструментом для количественной оценки в критическом клеточной популяции, если и в какой степени, химикат может вызывать мутации, которые потенциально могут привести к раку. Применение ферментативного количественного анализа для количественной оценки мутаций стволовых клеток в гене глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Х-хромосомой уже сообщалось ранее. 1 Этот метод требует подготовки замороженных срезов и инкубации секционного ткани с реакционной смеси, что приводит к синий цвет, если клетки продуцируют функциональный глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) фермент. Если нет, то появляются беловатые клетки. Мы модифицировали реакционной смеси с использованием оптимальных температуры резания Соединение (OCT) среды в месте поливинилового спирта. Это облегчает измерение рН, повышает растворимость компонентов Г6ФД окрашивания и ограничивает диффузию Г6ФД фермента. Чтобы продемонстрировать, что мутация произошла в стволовой клетки, вся склепа должны хватает Г6ФД ферментативныеМероприятия. Только если стволовая клетка питает фенотипическим мутации Г6ФД будет все потомство в крипты хватает Г6ФД ферментативную активность. Чтобы определить склепов с мутацией стволовых клеток, четыре последовательных смежных замороженные срезы (уровень) были вырезаны в 7 мкм толщиной. Этот подход сделать соседние сокращений обеспечивает конформацию, что склеп был полностью мутировал так же мутировавший склепа будет наблюдаться в соседних секций. Слайды с образцами тканей, которые были более, чем 50 мкм друг от друга были готовы оценить в общей сложности 10> 4 склепов на мышь. Частота мутации число наблюдаемых мутантных (белых) крипт ÷ на количество дикого типа (синий) крипт в группе лечения.
Introduction
Рак толстой кишки, как полагают, подвержен воздействию окружающей среды агентов и пищевых компонентов, которые могут повредить ДНК и производить активации соматических мутаций в онкогены (например, SS-катенин) или инактивации мутации в генах супрессоров опухолей (например, APC). Предполагается, что эти критические мутации происходят в толстой стволовых клеток. Из-за уникального крипт архитектуры ободочной эпителия, можно измерить стволовых клеток мутации в толстой кишке после экспонирования животных к химикатам, связанных с толстой кишки канцерогенеза. Несколько Х-сцепленные ферменты могут служить в качестве индикаторов мутаций, которые происходят в стволовых клетках, так как мутации будут присутствовать во всех клетках крипты внутри.
Ранее процедура была опубликована демонстрируя, что химические вещества, которые вызывают опухоли толстой кишки у мышей также генерируется соматических мутаций стволовых клеток в толстой кишке с помощью анализа мутаций в Х-хромосомой глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (G6PD) генов. 1-3Метод определяет количество случаев случайных соматических мутаций в толстой стволовых клеток без давления отбора. Процедура включает в себя производство незаписанных участков толстой кишки замороженных из обработанных и контрольных мышей и определение склепов, лишенных клеток, которые производят функциональную активность Г6ФД. Эти мутантные склепов, которые кажутся белыми, показывают, что мутация произошла в стволовой клетки, которые привели к потомству также укрывательство мутантный ген G6PD. В ферментативного количественного анализа, Г6ФД дефицитных мутантных крипты не может окислить глюкозо-6-фосфат, который необходим для снижения нитро синего тетразолия (NBT). Когда Г6ФД фермента функционально, НБТ в окрашивания смеси снижается до нерастворимого формазана и осадков, накапливая на месте фермента и "окрашивания" клеток синего. Клетки, которые Г6ФД мутанты остаются беловатые, в отличие от синих окрашенных диких склепов типа. Этот метод измеряет мутации, которые имеют «нулевого» фенотип. Потому что анзимов, такие как G6PD, могут диффундировать из клеток на участке нефиксированной ткани, если участки размещены в водном растворе, необходимо, чтобы стабилизировать фермент в срезах тканей для анализа. 4 Стабилизация фермента в ткань не должна мешать диффузии малых молекул реагентов, необходимых для реакции ферментативного Г6ФД.
Мы сделали ряд существенных изменений в первоначальной процедуре. Среда для критической ферментативного окрашивания был изменен с поливинилового спирта с Оптимальное температуры резания соединения (OCT), что облегчает контроль рН и растворение компонентов, используемых в анализе. Окрашивание осуществляется с использованием 0,4 – 0,5 мл колодцев из стальными шайбами так, чтобы каждый срез ткани животных получала такой объем реакционной смеси Г6ФД. Процедура была разработана, чтобы оценить количество крипт в виде изображения сечения, которая обеспечивает большой выборки толстой ткани безвручную рассчитывать> 10 5 склепов для каждого толстой кишки. Анализ соседних участков ткани 7 мкм обеспечивает визуализацию мутантного склепе на более чем одного слайда, который снижает потенциальные артефакты окрашивания. Эти изменения делают процедуру более эффективным и воспроизводимым.
Используя этот пересмотренный протокол, мы количественно частоты мутаций в клетках ободочной стволовых после воздействия на мышей C57BL / 6, чтобы azoxymethane, известный канцероген толстой кишки у грызунов. 5-7
Protocol
Representative Results
Discussion
Часто генотоксичных эффект соединения определяют по его способности изменять ДНК. Обычно это делается путем выделения ткани и измерения глобальный уровень аддуктов ДНК. Для острого среднего отита, это будет означать количественного O 6 -methylguanine аддукты в толстой кишке. Используя …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы не имеют подтверждения.
Materials
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. The clonal origin of experimental large bowel tumours. Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).
- Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity. Mutat. Res. 379 (1), (1997).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide. Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).
- Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
- Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane. Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).
- Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells. J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). J Vis Exp. (35), (2010).
- Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice. J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).
- Whetstone, R. D., Gold, B. T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon. Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).
- Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).
- Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation. J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).
