Kvantifiering av Kolon Stem Cell Mutationer

Summary

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Abstract

Möjligheten att mäta stamcells mutationer är ett kraftfullt verktyg för att kvantifiera i en kritisk cellpopulation om och i vilken utsträckning kan en kemikalie framkalla mutationer som potentiellt leda till cancer. Användningen av en enzymatisk analys för att kvantifiera stamcells mutationer i X-bunden glukos-6-fosfatdehydrogenas-gen har rapporterats tidigare. ¹ Denna metod kräver framställningen av frysta snitt och inkubering av den sektionerade vävnaden med en reaktionsblandning som ger en blå färg om cellerna producerar funktionell glukos-6-fosfatdehydrogenas (G6PD) enzym. Om inte, cellerna förefaller vitaktig. Vi har modifierat reaktionsblandningen med användning av Optimal Cutting Temperature Förening (oktober) mediet istället för polyvinylalkohol. Detta underlättar pH-mätning ökar solubilisering av G6PD färgnings komponenter och begränsar diffusion av G6PD enzymet. För att visa att en mutation inträffade i en stamcell, måste hela kryptan saknar G6PD enzymatiskaktivitet. Endast om en stamcell hyser en fenotypisk G6PD mutation kommer alla avkomman i kryptan saknar G6PD enzymatisk aktivitet. För att identifiera kryptor med stamcells mutation, var fyra på varandra följande intilliggande frysta snitt (en nivå) skärs vid 7 pm tjocklekar. Detta tillvägagångssätt för att göra angränsande snitt ger konformation som en krypta var helt muterad eftersom samma muterade kryptan kommer att observeras i angränsande sektioner. Diabilder med vävnadsprover som var mer än 50 um isär var beredda att bedöma totalt> 10 ⁴ kryptor per mus. Mutationsfrekvensen är antalet observerade muterade (vit) kryptor ÷ av antalet vilda typ (blå) kryptor i en behandlingsgrupp.

Introduction

Tjocktarmscancer är tänkt att innebära exponering för miljöfarliga ämnen och kostkomponenter som kan skada DNA och producera aktivera somatiska mutationer i onkogener (t.ex. ß-catenin) eller inaktivera mutationer i tumörsuppressorgener (t ex, APC). Det antas att dessa kritiska mutationer sker i kolon stamceller. På grund av den unika krypta arkitektur av kolon epitel, är det möjligt att mäta stamcells mutationer i kolon efter exponering djur mot kemikalier associerade med kolon karcinogenes. Flera X bundna enzymer kan fungera som indikatorer för mutationer som sker i stamceller, eftersom mutationerna kommer att vara närvarande i alla celler inom en krypta.

Tidigare har ett förfarande publicerades visar att kemikalier som inducerar kolontumörer i möss gav också somatiska stamcells mutationer i tjocktarmen via analys av mutationer i X-bunden glukos-6-fosfatdehydrogenas (G6PD) genen. ^1-3Metoden kvantifierar förekomsten av slumpmässiga somatiska mutationer i kolon stamceller utan selektionstryck. Förfarandet innebär produktion av ofixerade frysta kolon sektioner från behandlade och kontrollmöss och identifieringen av kryptor saknar celler som producerar funktionell G6PD aktivitet. Dessa muterade kryptor, som visas vitt, tyder på att mutationen inträffade i en stamcell som gav upphov till avkomma också hyser en muterad G6PD gen. I enzymatisk analys, kan G6PD brist mutanta kryptor inte oxidera glukos-6-fosfat, som krävs för reduktion av nitroblått-tetrazolium (NBT). När G6PD enzymet är funktionell, är NBT i färgning blandningen reduceras till olösligt formazan och fällningar, ackumulera vid stället för enzymet och "färgnings" celler blue. Celler som är G6PD mutanter förblir vitaktig i motsats till blåfärgade vild typ kryptor. Denna metod mäter mutationer som har en "noll" fenotyp. Eftersom svZymes, såsom G6PD, kan diffundera ut från cellerna på en ofixerade vävnadssnitt om sektionerna placeras i en vattenhaltig lösning, är det nödvändigt att stabilisera enzymet i vävnadssnitt som skall analyseras. ⁴ Stabiliseringen av enzymet i vävnad får inte påverka spridningen av små reagensmolekyler som är nödvändiga för G6PD enzymatiska reaktionen.

Vi har gjort ett antal betydande ändringar i den ursprungliga proceduren. Mediet för det kritiska enzymatiska färgning har ändrats från polyvinylalkohol att Optimal Cutting Temperature Förening (oktober), vilket underlättar pH-reglering och solubilisering av de komponenter som används i analysen. Färgningen utförs med användning av 0,4 – 0,5 ml brunnar gjorda av stålbrickor så att varje vävnadssektion erhöll samma volym av G6PD reaktionsblandningen. Ett förfarande utvecklades för att uppskatta antalet kryptor i ett avbildat avsnitt som tillhandahåller en stor provtagning av kolonvävnad utan att haatt manuellt räkna> 10 ⁵ kryptor för varje kolon. Analysen av intilliggande 7 pm vävnadssnitt ger visualisering av en mutant krypta på mer än en bild, vilket minskar potentiella färgningsartefakter. Dessa förändringar gör förfarandet mer effektivt och reproducerbart.

Genom att använda denna reviderade protokoll, har vi kvantifierat mutationsfrekvensen i colon stamceller efter exponering av C57BL / 6-möss att azoximetan, en välkänd koloncancerframkallande hos gnagare. ^5-7

Protocol

De experimentella förfaranden och etisk behandling av djur godkändes av University of Pittsburgh IACUC (protokoll # 1104674). 1. Framställning av G6PD Färgning Blandning OBS: Se till att den slutliga koncentrationen av varje reagens är följande; 5 mM glukos-6-fosfat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0,35 mM 1-metoxi-5-methylphenazinium metylsulfat (MMPMS) och 0,8 mM NBT. 1,8,9 För varje reagens den initiala koncentrationen härleddes för en 40 ml slutlig volym…

Representative Results

Möjligheten att mäta kolon stamcells mutationer hos djur ger ett unikt sätt att korrelera mutationer till cancerinduktion. Normalt antas det att det kritiska steget i karcinogenes involverar aktiverande mutationer i onkogener och / eller inaktiverande mutationer i tumörsuppressorgener. Vi injicerade C57BL / 6-möss med 200 pl PBS eller 10 mg / kg AOM i 200 fil PBS. AOM är en känd kolon cancerframkallande. 5-7 Vid 90 dagar kolon analyserades med avseende stamcells mutationer. Denna tid krävs för att g?…

Discussion

Ofta den genotoxiska effekten av en förening bestäms av dess förmåga att modifiera DNA. Detta sker normalt genom att isolera vävnaden och mäta den totala nivån på DNA-addukter. För AOM, skulle detta innebära att kvantifiera O ⁶ -methylguanine addukter i tjocktarmen. Med användning av detta tillvägagångssätt information om skador inom specifika celltyper, såsom i stamcellsnischen, går förlorad. Dessutom är en DNA-addukt inte samma sak som en mutation eftersom endast en liten delmängd av addu…

Materials

reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room