Mikrobiologisk Induced Kalsitt Nedbør mediert av<em> Sporosarcina pasteurii</em

Summary

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Abstract

Den spesielle bakterien under etterforskning her (S. pasteurii) er unik i sin evne, under de rette forholdene, for å indusere hydrolyse av urea (ureolysis) i naturlig forekommende miljøer gjennom utskillelse av et enzym urease. Denne prosessen med ureolysis, gjennom en kjede av kjemiske reaksjoner, fører til dannelse av kalsiumkarbonat utfellinger. Dette er kjent som Mikrobiologisk Induced Kalsitt nedbør (MICP). De riktige kultur protokoller for MICP er beskrevet her. Til slutt ble visualiserings forsøk under forskjellige moduser av mikroskopi utført for å forstå forskjellige aspekter av utfellingsprosessen. Teknikker som optisk mikroskopi, ble Scanning elektronmikroskopi (SEM) og X-Ray foto-elektronspektroskopi (XPS) som anvendes for kjemisk å karakterisere sluttproduktet. Videre ble evnen til disse utfellinger for å tette porene i et naturlig porøst medium demonstrert gjennom en kvalitativ eksperiment hvor svampPlatene ble brukt til å etterligne en pore-nettverk med en rekke lengdeskala. En svamp bar dyppet i dyrkningsmedium inneholdende bakteriecellene stivner på grunn av tilstopping av porene som følge av den kontinuerlige prosessen med kjemisk utfelling. Dette herdet svamp bar viser overlegen styrke sammenlignet med en kontrollgruppe svamp bar som blir komprimert og presset under påvirkning av en påført ytre belastning, mens herdet baren er i stand til å støtte den samme vekten med lite deformasjon.

Introduction

Sporosarcina pasteurii er en gram-positive bakterien i stand til å overleve i svært alkaliske miljøer (pH ~ 10) ¹ og er en av de bakteriearter som kan bli en utløsende agent for et fenomen som kalles Mikrobiologisk Induced Kalsitt nedbør (MICP) ^2-4. MICP er en prosess hvori utfelling av kalsiumkarbonat induseres av visse mikroorganismer under egnede forhold i omgivelsene. S. pasteurii har antatt betydning i de siste årene på grunn av sin identifikasjon som et mulig middel for å fremkalle betydelige mengder MICP under visse betingelser. Denne mulighet stammer fra det faktum at S. pasteurii har den unike evnen til å skille ut store mengder av enzymet urease. Dette enzym virker som en katalysator, fremme en akselerert lysering av urea (et naturlig forekommende biokjemisk forbindelse med utbredt og rikelig tilførsel) i nærvær av vannmolekyler. Gjennom en kaskade av reaksjoner, er denne prosessen endeligely fører til generering av negativt ladede karbonationer. Disse ioner, i sin tur reagerer med positive metallioner som kalsium til slutt danne utfellinger av kalsiumkarbonat (kalsitt); derfor etiketten MICP ^5-9.

Prosessen med MICP har vært kjent og studert i flere tiår ^10,11. I løpet av de siste årene, har MICP blitt undersøkt for et bredt spekter av engineering og miljøprodukter inkludert bottom-up grønn konstruksjon ^12, forbedring av store strukturer ^13,14 og karbonbinding og lagring ^15,16.

For eksempel Cunnigham ¹⁷ et. al utformet et høyt trykk moderat temperatur strømningsreaktor inneholdende en Berea sandsteinskjerne. Reaktoren ble inokulert med bakterier S. fridgidimarina og under forhold med høyt trykk kritisk karbondioksyd injeksjon, en massiv akkumulering av biomasse på innsiden av pore volvolumer ble observert, noe som førte til mer enn 95% reduksjon i permeabilitet. Jonkers og Schlangen ¹⁸ studert effekten av visse spesielle stammer av bakterier på selvhelbredende prosess i betong. Eksternt vann transportert inn i pore-nettverk som trenger inn gjennom de overflateporer er forventet å aktivere den sovende bakterier som i sin tur bidrar til strukturell styrke via MICP. Tobler ¹⁹ et al. har sammenlignet ureolytic aktiviteten av S. pasteurii med en innfødt grunnvann ureolytic mikrokosmos under betingelser som favoriserer store MCIP og fant at S. pasteurii har en konsekvent evne til å forbedre kalsitt nedbør selv når urfolkssamfunn manglet før urease aktivitet. Mortensen ²⁰ et.al har studert effekten av ytre faktorer som jordtype, konsentrasjon av ammoniumklorid, saltholdighet, oksygenkonsentrasjon og lysis av celler på MICP. Deres demonstrasjon på at den biologiske renseprosessen er meget robust med respect til en stor variasjon i parameter plass underbygger trenings av denne prosessen for en rekke store utbedring programmer som tilbys en skikkelig berikelse prosess for å forsterke bakteriene er foretatt. Phillips ²¹ et. al utformet eksperimenter for å studere forandringer i permeabilitet og styrke av en sand-kolonne og en sandsteinkjerne etter å ha blitt injisert med S. pasteurii kulturer. De fant at mens permeabiliteten redusert 2 – 4 ganger så lenge bruddstyrken økes tre ganger.

S. pasteurii og dens rolle i MICP er tema for aktiv forskning og flere spørsmål knyttet til mekanismen for kjemisk felling er fortsatt ikke fullt ut forstått. I lys av dette, er det svært viktig å ha et sett av konsistente standardiserte protokoller for nøyaktig kultur en passende beriket lager av S. pasteurii å oppnå MICP. Her skisserer vi en streng protokoll som vil sikre repeterbarhet og reproduserbarhet. dette manuscript beskriver detaljerte protokoller for dyrking S. pasteurii og hensiktsmessig å anrike kulturmediet for å indusere utfelling. Prosessen blir undersøkt ved forskjellige mikroskopiske teknikker så som optiske og Scanning elektronmikroskopi (SEM) og X-Ray foto-elektronspektroskopi (XPS). Fokuset i manuskript er på prosessen med MICP. Prosedyrer som SEM og SIMS, blir veletablerte standardprotokoller, ikke er særskilt beskrevet.

Protocol

MERK: Utfør de eksperimentelle protokollene i den rekkefølgen som er beskrevet nedenfor. Bakteriekultur protokollen er omtalt i kapittel 1 (se også figur 1). Avsnitt 2 beskriver protokollen for berikende kulturmediet ved hjelp av eksterne tilsetningsstoffer. § 3 beskriver protokollene for multi-mode mikroskopi. Vekter av alle de individuelle komponentene kan måles ved anvendelse av en analysevekt. Volum av hver løsning kan måles ved hjelp av en volumetrisk sylinder. M…

Representative Results

S. pasteurii være en alkalifil 24 kan overleve relativt tøffe forhold. Når den ovennevnte kultur-protokollen blir fulgt, og S. pasteurii dyrkes inne i et kammer, bakterier fører til utfelling av kalsiumkarbonat over tid (figur 2A). Figur 2 (b) viser et fasekontrast optisk mikroskopisk bilde av bakteriecellepopulasjon i kulturmediet. Enkeltceller kan være tydelig atskilt, med stavlignende figurer karakteristiske av Bacill…

Discussion

Kritiske trinn: Dette manuskriptet beskriver i detalj de protokoller for dyrking av en levedyktig utvalg av S. pasteurii. Etter at kulturen er blitt klargjort, må det være passende beriket. Dette er et viktig skritt avgjørende for å lykkes med forsøket fordi en unnlatelse av å gi riktig kjemisk miljø fører til enten svært lange tidsskalaer av nedbør eller en komplett mangel. S. pasteurii er ganske følsom for flere eksterne etater og må dyrkes med en høy grad av omsorg og p…

Materials

Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80°C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium