Inducida microbiológicamente Calcita precipitación mediada por<em> Sporosarcina pasteurii</em

Summary

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Abstract

La bacteria en particular bajo investigación aquí (S. pasteurii) es único en su capacidad, en las condiciones adecuadas, para inducir la hidrólisis de la urea (ureolysis) en entornos naturales a través de la secreción de una enzima ureasa. Este proceso de ureolysis, a través de una cadena de reacciones químicas, conduce a la formación de precipitados de carbonato de calcio. Esto se conoce como inducida microbiológicamente Calcita Precipitación (MICP). Los protocolos de cultivo adecuados para MICP se detallan aquí. Por último, se realizaron experimentos de visualización en diferentes modos de microscopía de comprender diversos aspectos del proceso de precipitación. Técnicas como la microscopía óptica, se emplearon Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) y X-Ray Photo-electrón Spectroscopy (XPS) para caracterizar químicamente el producto final. Además, la capacidad de estos precipitados a obstruir los poros dentro de un medio poroso naturales se demostró a través de un experimento cualitativo donde esponjabarras se utilizan para imitar un poro de la red con una gama de escalas de longitud. Una barra de esponja sumergido en el medio de cultivo que contiene las células bacterianas se endurece debido a la obstrucción de sus poros resultantes del proceso continuo de precipitación química. Esta barra de esponja endurecido exhibe una resistencia superior en comparación con una barra de esponja de control que se comprime y apretó bajo la acción de una carga externa aplicada, mientras que la barra de endurecido es capaz de soportar el mismo peso con poca deformación.

Introduction

Sporosarcina pasteurii es una bacteria gram-positiva capaces de sobrevivir en entornos altamente alcalinas (pH ~ 10) ¹ y es uno de las especies bacterianas que pueden convertirse en un agente causal de un fenómeno llamado inducida microbiológicamente Calcita Precipitación (MICP) ^2-4. MICP es un proceso en el que la precipitación de carbonato de calcio es inducido por ciertos microbios en condiciones ambientales adecuadas. S. pasteurii ha cobrado importancia en los últimos años debido a su identificación como un posible agente para inducir un volumen significativo de MICP bajo ciertas condiciones. Esta posibilidad surge del hecho de que S. pasteurii tiene la capacidad única de secretar grandes cantidades de la enzima ureasa. Esta enzima actúa como un catalizador, la promoción de una lisis acelerada de urea (un compuesto orgánico que existe de forma natural con el suministro generalizada y abundante) en presencia de moléculas de agua. A través de una cascada de reacciones, este proceso finalLy conduce a la generación de iones carbonato con carga negativa. Estos iones, a su vez, reaccionan con iones metálicos positivos como el calcio para formar finalmente precipitados de carbonato de calcio (calcita); por lo tanto, la etiqueta MICP ^5-9.

El proceso de MICP ha sido conocido y estudiado durante varias décadas ^10,11. En los últimos años, se ha investigado MICP para una amplia gama de aplicaciones ambientales, incluyendo la construcción verde de abajo hacia arriba ^12, la mejora de las estructuras a gran escala ^13,14 y la captura de carbono y almacenamiento ^15,16 ingeniería y.

Por ejemplo, Cunnigham ¹⁷ et. Al diseñado un reactor de flujo temperatura moderada a alta presión que contiene un núcleo de arenisca Berea. El reactor se inoculó con las bacterias S. fridgidimarina y en condiciones de inyección de dióxido de carbono supercrítico a alta presión, una acumulación masiva de biomasa dentro del poro volse observó umes, lo que condujo a la reducción de más de 95% de la permeabilidad. Jonkers y Schlangen ¹⁸ estudiaron el efecto de ciertas cepas especiales de bacterias en el proceso de auto-sanación en el hormigón. Se espera externa de agua transportada en la red de poros entra a través de los poros de la superficie para activar las bacterias inactivas que a su vez ayudan a la resistencia estructural a través de MICP. Tobler ¹⁹ et al. han comparado la actividad de S. ureolíticas pasteurii con un agua subterránea microcosmos ureolíticas indígena en condiciones que favorecen MCIP a gran escala y se encontró que S. pasteurii tiene una capacidad constante para mejorar la precipitación de calcita incluso cuando las comunidades indígenas carecían de actividad de la ureasa antes. Mortensen ²⁰ et.al han estudiado los efectos de los factores externos, como el tipo de suelo, la concentración de cloruro de amonio, salinidad, concentración de oxígeno y la lisis de las células en MICP. Su demostración de que el proceso de tratamiento biológico es muy robusto con respect a una amplia variación en el espacio de parámetros corrobora la idoneidad de este proceso para diversas aplicaciones de remediación a gran escala proporciona un proceso de enriquecimiento adecuado para reforzar las bacterias se lleva a cabo. Phillips ²¹ et. al diseñado experimentos para estudiar los cambios en la permeabilidad y la fuerza de una columna de arena y un núcleo de arenisca después de haber sido inyectados con S. culturas pasteurii. Ellos encontraron que mientras que la permeabilidad disminuyó 2 – 4 veces, mientras que la resistencia a la fractura aumentó tres veces.

S. pasteurii y su papel en MICP son temas de investigación activa y varias cuestiones relacionadas con el mecanismo de precipitación química todavía no se entienden completamente. A la luz de esto, es muy importante contar con un conjunto de protocolos estandarizados coherentes con la cultura con precisión una población enriquecida de manera adecuada S. pasteurii para lograr MICP. A continuación, se describe un protocolo riguroso que garantice la repetibilidad y la reproducibilidad. esta manuscript describe los protocolos detallados para el cultivo de S. pasteurii y adecuadamente el enriquecimiento del medio de cultivo para inducir la precipitación. El proceso se investigó a través de diversas técnicas microscópicas tales como óptica y microscopía electrónica de barrido (SEM) y X-Ray Photo-electrón Spectroscopy (XPS). El foco del manuscrito está en el proceso de MICP. Los procedimientos como SEM y SIMS, siendo protocolos estándar bien establecidos, no se describen por separado.

Protocol

NOTA: Realice los protocolos experimentales en el orden que se describe a continuación. El protocolo de cultivo bacteriano se discute en la Sección 1 (véase también la figura 1). Sección 2 se describe el protocolo para enriquecer el medio de cultivo utilizando aditivos externos. Sección 3 describe los protocolos para la microscopía de multi-modo. Los pesos de todos los componentes individuales se puede medir usando una balanza analítica. Volumen de cada solución se puede medir usando un cilindr…

Representative Results

S. pasteurii ser un Alcalófilo 24 puede sobrevivir en condiciones relativamente duras. Cuando el protocolo de cultivo antes mencionado se siguió, y S. pasteurii se cultiva dentro de una cámara, las bacterias lleva a la precipitación de carbonato de calcio con el tiempo (Figura 2A). La figura 2 (b) muestra una imagen microscópica óptica de contraste de fases de la población de células bacterianas en el medio de cultivo…

Discussion

Los pasos críticos: Este manuscrito describe en detalle los protocolos para el cultivo de una muestra viable de S. pasteurii. Una vez que el cultivo ha sido preparado, que debe ser enriquecida adecuadamente. Este es un paso clave fundamental para el éxito del experimento debido a una falta de proporcionar el ambiente químico adecuado conduce a cualquiera de las escalas de tiempo muy largos de precipitación o una falta completa de la misma. S. pasteurii es bastante sensible a varios…

Materials

Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80°C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium