Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
Bu protokol aselüler, organ ölçekli doku gelişimi için küçük ölçekli modeli yüzeyler olarak yararlıdır henüz Biyofonksiyonel, böbrek hücre dışı matriks (ECM) iskelelerinin üretimi göstermektedir. Sprague Dawley sıçan böbrek bozulmamış sağlam, tüm böbrek iskeleleri elde etmek için 26 saat boyunca renal arter içine bir kateter sokulmasıyla kanül vasıtasıyla sokuldu ve düşük konsantrasyonlu deterjan (Triton X-100 ve sodyum dodesil sülfat (SDS)), bir dizi ile perfüze edilmiştir perfusable damar, glomerüller ve böbrek tübülleri. Decellularization takiben renal skafold özel tasarlanmış bir perfüzyon biyoreaktör kap içine yerleştirilir, ve buraya kateter sokulur renal arter oluşan bir perfüzyon devresine bağlanır: bir peristaltik pompa; boru; pH, çözünmüş oksijen ve basınç için isteğe problar. Perasetik asit ve etanol ve pH (7.4) balans iskele sterilizasyon işleminden sonra, böbrek skafold larg içinde kültür ortamının perfüzyon yoluyla tohumlama için hazırlanırE kapasiteli kuluçka CO2 37 ° C'de muhafaza edildi ve% 5. Kırk milyon renal kortikal tübüler epitel (RCTE) hücreler fizyolojik bir orana akışını azaltarak önce 15 dakika için yüksek akış altında iskele (25 ml / dakika) ve basınçta (~ 230 mmHg) arasında renal arter yoluyla enjekte edilir ve hızlı bir şekilde perfüze edilir (4 mL / dakika). RCTE hücreler öncelikle, renal korteks içinde tübüler ECM niş doldurmak çoğalırlar ve perfüzyon kültür yedi gün boyunca tübüler epitel yapıları oluşturmak. Kültür ortamı içinde bir 44 uM resazurin çözeltisi tubulogenesis esnasında hücre canlılığı ve proliferasyonu, bir florometrik, redoks-kaynaklı metabolik bir değerlendirme sağlamak için orta değişimleri sırasında 1 saat böbrek içinden perfüze edilmiştir. Böbrek perfüzyon biyoreaktör biyokimyasal değerlendirme için ortamın non-invaziv örnekleme izin verir ve birden fazla giriş portları renal ven ya da üreter yoluyla alternatif retrograd tohumlama izin verir. Bu protokoller, bir böbrek iskeleleri recellularize için kullanılabilirBu sistem içinde hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için, vasküler endotelyum, tübüler epitel, stromal fibroblastlar, de dahil olmak üzere hücre tiplerinin çeşitliliği.
Introduction
Son dönem böbrek yetmezliği olan hasta sayısı artmaya devam ettikçe, transplantasyon için uygun donör böbreklerin sayısında ciddi ve büyüyen sıkıntısı yoktur. adayların sürekli artan sayıda talebi karşılamak için yetersizlik böbrek nakli için bekleme listesine talep üzerine 1,2, implante böbrek greft özelleştirilmiş gelişmekte nihai hedefi ile böbrek, organ mühendisliği araştırma yol açtı. Bir hastanın kendi hücrelerinden işleyen böbrek dokusunu Bina, yaşam boyu immünosüpresyon ihtiyacını ortadan kaldırmak hastaların böbrek nakli için bekleyen diyaliz harcadıkları zamanı miktarını azaltmak ve kronik böbrek hastalığı olan hastalara daha fazla hayat kurtaran nakli genişletmek istiyorum.
Hasta türetilmiş hücreler kullanılarak böbrek dokusunu biyomühendislik doğru ilk adım böbrek parankimi için destekleyici substrat olarak hizmet veren bir iskele geliştirmektir (örneğin boru şeklindeki epitheLIAL), stroma fibroblast ve vasküler hücre büyümesi. Doğal bir organ, hücre dışı matrislerin (ECM) elde edilen biyomalzeme iskelelerde doğal biyolojik bileşim içeren doku mühendisliği, içinde kullanım için arzu edilir hale getiren çeşitli özelliklere sahiptir; Uygun makro ve mikro fizyolojik fonksiyonu bağışlamak için; ve hücresel biyouyumluluk, hücre yapışmasını, göç, ve 3 biçimlenme yapıcı doku teşvik. Renal doku rejenerasyonu için iskeleler üretmek için bir umut verici bir yöntem, böbrek ECM 4 kompleks doğal protein bileşiminin çok korumak organın doğal mimari karışıklık korumak ve fleklinden ile ilişkili zorluğun üstesinden allojenik veya ksenogeneik böbreklerin decellularization geçer iskele recellularization 5 sonra gelişen hücrelere vasküler kaynağı sağlayarak kalın cellularized dokuların mühendislik kadar.
Perfüzyon decellularization bir işlem olupki deterjanlar, enzim ya da diğer hücre bozucu çözeltiler homojen organı 6 vasküler ağ üzerinden teslim edilir. Bu strateji atılan insan böbrekler 9'dan asellüler böbrek şablonlar gelişimi ile kanıtlandığı gibi, tüm organ mühendisliği 6-8 biyolojik şablonlar, (3D) üç boyutlu olarak asellüler organa tabanlı ECM iskeleleri türetmek için verimli bir süreç olarak kurulmuştur ve büyük hayvan (örneğin, domuz 10, keçi 11) ve kemirgen kaynakları 12 elde ksenogeneik böbrekler. Özellikle, kemirgenler gibi küçük hayvan modellerin kullanımı daha az hücreleri ve kök hücre türevli dokuları ile olduğu gibi, hücre sayısı genellikle sınırlı olan organ Recellularization çalışmalar için özellikle yararlı olan kültür ortamı, gerektirir. tarif edilen decellularization protokolünün amacı, böbrek structur rejenerasyonu için 3 boyutlu bir iskele sistemi olarak kullanılan bir hücresel olmayan böbrek ECM üretmektirİnsan renal kortikal tübüler epitel (RCTE) hücreleri ile mevcut örnekte yeniden doldurulur nefron tübüller dahil es. Daha önce daha hızlı olan bir optimum, deterjan bazlı sıçan böbrek decellularization protokolü 7, daha önce bildirilen diğer yöntemlere göre (yaklaşık bir gün) titiz değerlendirme tarif edildiği gibi (Ross ve ark .- 5 gün 12, Song ve ark .- 4.5 gün 13), ve daha önceki raporlarda 12-15 daha decellularization sırasında denatüran sodyum dodesil sülfat (SDS) oldukça düşük bir konsantrasyonda (% 0.1) organın ortaya koyar.
Bazı çalışmalar, sınırlı sayıda hücre yeniden popüle için 3 boyutlu bir iskele olarak decellularization ve daha sonraki kullanım için, kemirgen böbrek kullanımını tarif etmişlerdir 12-16 (başka yerde 1 incelenmiştir). Bu protokol, biz aselüler böbrek iskeleleri üretmek için bizim daha önce kurulmuş, optimum decellularization stratejisinin ayrıntılı bir açıklamasınıSprague Dawley sıçan böbreklerinde 7 den. Çift ekim ve bakım perfüzyon kültürünün 17 yetenekli özel tasarlanmış perfüzyon biyoreaktörler kullanarak, sürekli bu decellularized matrislerdeki boru şeklindeki bileşeni yeniden doldurmanız çoğalırlar ve bir hafta boyunca perfüzyon kültüründe hayatta insan RCTE hücreleri ile asellüler böbrek iskeleleri recellularize. 17 çalışmaları önceden sitotoksisite için kullanılan ucuz, non-sitotoksik ve non-invaziv metabolik değerlendirilmesi – – zaman 7'nin üzerinde recellularized böbrekler içinde hücre canlılığı ve çoğalması bir gösterge sağlamak için Biz daha resazurin perfüzyon testinin bizim kullanımını göstermek.
Protocol
Representative Results
Discussion
tarif edilen decellularization protokolü sürekli olarak vasküler endotel hücrelerinin 7,17 ilave olarak, (yakın ve uzak olan tübül-türetilmiş) insan renal kortikal tübüler epitel hücrelerin kültürü için 3 boyutlu bir şablon olarak hizmet veren bir tam hücresel olmayan böbrek ECM üretir. kanüle renal damar sistemi, böylece perfüzyon decellularization hücre ekim, uzun vadeli bir perfüzyon kültürü ve resazurin perfüzyon protokolleri sağlayan bir biyoreaktör kurulumu olan iskele boy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
References
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
- Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
- Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
- Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
- Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).
