상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비
Summary
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Abstract
이 프로토콜은 무 세포, 장기 스케일 조직 개발 소규모 모델 기판으로서 유용하다 아직 biofunctional, 신장 세포 외 기질 (ECM) 비계의 발생 사항. 스프 라그 돌리 래트 신장이 손상으로 그대로, 전체 신장 골격을 유도하기 26 시간에 걸쳐 신장 동맥에 도관을 삽입하여 캐 뉼러와 저농도의 세제 (트리톤 X-100 및 소듐 도데 실 설페이트 (SDS))의 일련의 관류 관류 혈관, 사구체, 신장 세뇨관. 탈세 포화 후, 신장 지지체는 주문 설계된 관류 생물 반응기 용기 내부에 배치되고, 신장 동맥 카테터 이루어진 관류 회로에 연결되어 연동 펌프; 튜브; pH를, 용존 산소, 압력에 대한 옵션 프로브를. 아세트산 및 에탄올의 pH (7.4)를 분산과 발판 살균 후 신장 지지체는 내 larg의 배지로 관류 시드 제조전자 용량 CO 2 인큐베이터를 37 ℃로 유지하고 5 %. 천만 신피질 관상 상피 (RCTE) 세포 생리 레이트 흐름을 감소하기 전에 15 분 동안 고 유량 하에서 지지체 (25 ㎖ / 분) 압력 (~ 230 mmHg로)를 통해 신장 동맥을 통하여 주입, 급속 관류 (4 ㎖ / 분). RCTE 세포는 주로 신장 피질 내에서 관 ECM 틈새를 채우는 확산 및 관류 문화 7 일 동안 관 상피 구조를 형성한다. 배지에서 44 μM의 레사 주린 용액 중에 세뇨관 세포 생존 및 증식 형광, 레 독스 계 대사 평가를 제공하기 위해 교환 매질 중에 1 시간 동안 신장을 관류한다. 신장 관류 생물 반응기는 생화학 적 평가를 위해 매체의 비 침습적 샘플링을 허용하고, 여러 입구 포트는 신장 정맥 또는 요관을 통해 대안 역행 파종 할 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 신장과 골격을 recellularize하는데 사용될 수있다이 시스템 내에서 신속한 평가를위한 혈관 내피, 관 상피와 기질 섬유 아 세포를 포함한 세포 유형의 다양한.
Introduction
말기 신부전을 앓고있는 환자의 수는 계속 증가 같이, 이식 가능한 도너 신장의 수가 증가하고 심각한 부족이있다. 후보자의 지속적 증가 수의 수요를 충족 할 수없는이 신장 이식을 위해 상장 기다립니다 수요 1, 2에 이식 신장 이식을 사용자 정의 개발하는 궁극적 인 목표와 신장 장기 공학 연구를 묻는 메시지가있다. 환자 자신의 세포에서 작동 신장 조직을 구축하면, 평생 면역 억제에 대한 필요성을 제거 환자 신장 이식을 기다리고 투석에 소요되는 시간을 감소시키고, 만성 신장 질환을 가진 더 많은 환자에 구명 이식을 연장한다.
환자 유래의 세포를 사용하여 신장 조직 생명 공학 첫 걸음 신장 실질위한지지 기판으로서 기능하는 지지체를 개발하는 것이다 (예를 들어 관형 epithelial), 기질 섬유 아세포, 혈관 세포 성장. 자연 장기 세포 외 기질 (ECM들)에서 유래 생체 재료 지지체는 천연 생체 조성를 포함한 조직 공학에 사용하기에 바람직 수있는 여러 가지 특성을 가지고; 적절한 거시 및 미세 생리 학적 기능을 부여하는 단계; 휴대 생체 적합성, 세포 부착, 이동, 3 개조 건설적인 조직을 홍보. 신장 조직 재생 용 지지체를 제조하는 유망한 방법은 신장 ECM (4)의 복합 천연 단백질 조성물의 대부분을 보존 기관의 고유의 구조적 복잡함을 유지하고, 상향식과 관련된 어려움을 극복 동종 또는 이종 신장의 탈세 포화를 통해 비계 recellularization 5 후 개발 세포에 혈관 공급을 제공함으로써 두께 cellularized 조직 공학입니다.
관류 탈세 포화는 과정에있다이는 세제, 효소, 또는 다른 세포 방해 솔루션은 균일 기관 (6)의 혈관 네트워크를 통해 전달됩니다. 이 전략은 폐기 인간의 신장 (9)에서 무 세포 신장 템플릿의 개발에 의해 입증, 전체 기관 공학 6-8 생물학적 템플릿 (3D) 입체로 무 세포 기관 기반의 ECM 발판을 유도 할 수있는 효율적인 프로세스로 설립되었습니다 대형 동물 (예 : 돼지 10, 염소 11)과 설치류 소스 (12)로부터 얻은 이종 신장. 특히, 설치류 등의 작은 동물 모델의 사용은 더 적은 세포 및 줄기 세포 유래의 조직의 경우와 같이, 세포 수는 일반적으로 제한되는 장기 recellularization 연구에 특히 유용 배지를 필요로한다. 탈세 포화 기재된 프로토콜의 목적은 신장 structur의 재생을 위해 3D 발판 시스템으로 사용할 수 무 세포 신장 ECM을 생성한다인간의 신장 피질 관 상피 (RCTE) 세포와 본 실시 예에 다시 채워되는 네프론의 세관을 포함, ES. 우리는 이전보다 빠르다 최적의 세제 기반 쥐의 신장 탈세 포화 프로토콜 (7), 이전에보고 된 다른 방법보다 (약 일)의 엄격한 평가를 설명 (로스 등 .- 오일 (12), 노래 등 .- 4.5 일 13), 및 앞서보고 12-15보다 탈세 포화 중에 변성제 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)의 상당히 낮은 농도 (0.1 %)로 장기를 공개한다.
연구의 제한된 수의 세포 다시 채우기위한 3D 발판으로 탈세 포화 이후 사용 쥐 신장의 사용을 설명했다 12-16 (다른 1 검토). 이 프로토콜에서는, 우리는 무 세포 신장 지지체를 제조하는 우리의 이전에 설립 된 최적의 탈세 포화 전략에 대한 자세한 설명을 제공스프 라그 돌리 쥐의 신장 7. 이중 파종 및 유지 보수 관류 문화 (17) 할 수있는 맞춤 디자인 관류 생물 반응기를 사용하여, 우리는 지속적으로 이러한 탈세 포화 행렬에 관 구성 요소를 다시 채울 증식하고, 주일 이상 관류 문화에서 살아 남기 인간 RCTE 세포와 무 세포 신장 발판을 recellularize. (17) 연구 이전에 세포 독성에 사용되는 비용이 들지 않는, 세포 독성, 비 침습적 대사 평가 – – 시간 7 위에 recellularized 신장 내 세포 생존 및 증식의 표시를 제공하기 위해 우리는 더 레사 주린 관류 분석의 우리의 사용을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
탈세 포화 기재된 프로토콜 일관 혈관 내피 세포 7,17 이외에 (근위 및 원위 세관 모두 유래) 인간 신피질 관상 상피 세포의 배양을위한 3 차원 템플릿 역할 완전히 무 세포 신장 ECM을 생성한다. 삽관 신장 맥관 따라서 관류 탈세 포화, 세포 시딩 장기 관류 배양하고, 레사 주린 관류 프로토콜을 가능하게 바이오 리액터 셋업 내의 지지체 걸쳐 시약 및 세포의 균일 한 전달을위한 주요 기능으?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Materials
| Reagents | |||
| TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Peracetic acid solution, purum, ~39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
| DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Equipment: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
| Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
| *Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
| Perfusion Circuit Components | |||
| 24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
| Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
| Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16"id X 1/8"OD, 25 Ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
| VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
| Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L – 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
| Other Components | |||
| 5 mL BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
References
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
- Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
- Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
- Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
- Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
- Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
- Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).
