Omskrevet Capsular Infarkt modellering ved hjelp av en Photothrombotic Technique

Summary

Dette manuskriptet beskriver en modelleringsteknikk av kapsel infarkt. Her benyttet vi en modifisert photothrombotic teknikk med lav intensitet av lys etter pre-kirurgi mål kartlegging. Ved hjelp av denne teknikken, har vi opprettet en omskrevet kapsel infarktet modell med vedvarende motor verdifall.

Abstract

Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for white matter stroke has hampered research investigations. Here, we describe a novel method for creating a circumscribed capsular infarct that minimizes damage to neighboring gray matter structures. We used pre-surgery neural tracing with adeno-associated virus-green fluorescent protein (AAV-GFP) to identify somatotopic organization of the forelimb area within the internal capsule. The adjustment of light intensity based on different optical properties of gray and white matter contributes to selective destruction of white matter with relative preservation of gray matter. Accurate positioning of optical-neural interface enables destruction of entire forelimb area in the internal capsule, which leads to a marked and persistent motor deficit. Thus, this technique produces highly replicable capsular infarct lesions with a persistent motor deficit. The model will be helpful not only to study white matter stroke (WMS) at the behavioral, circuit, and cellular levels, but also to assess its usefulness for development of new therapeutic and rehabilitative interventions.

Introduction

Inntil nylig har den "grå materie slag (GMS) modeller" er utelukkende brukt til å forstå patofysiologien for slag og for å lede utviklingen av nye behandlingsmetoder. Imidlertid har det vært en økende forekomst av hjerneslag som rammer subcortikal hvit substans hos eldre personer, som utgjør 15-25% av alle slag ^1,2. Tallrike studier har blitt utført av hjerneslag ved hjelp av GMS-modeller, mens det er få studier som har brukt hvit substans slag (WMS) modeller. Hvit substans i gnagere er vesentlig mindre enn den hvite substansen i mennesker eller primater. Følgelig, er det vanskeligere for selektivt å åpne og ødelegge målregioner i hvit substans ^3. I tillegg har noen effektive verktøy er utviklet for å date for å selektivt ødelegge den planlagte omfanget av målrettet hvit substans. Derfor har det vært mangel på egnede modeller for studier av hvit substans slag.

Animal stRoke modeller blir ofte brukt til å overvåke utviklingen av motor utvinning for utvikling av ny rehabiliterende og terapeutiske metoder. Det er ideelt å benytte en dyremodell som viser en langsiktig nevrologiske utfall konkordant med anatomiske forandringer påvist i menneskelig hjerneslag ^4,5. I denne forbindelse, kan rask gjenoppretting av motorisk svikt og bred involvering av hjernen etter infarktet lesioning ikke være realistisk i jakten på hjerneslag forskning. Tidligere kapselinfarkt modeller har blitt gjort av okklusjon av carotis interna eller anterior koroidal arterier og spredning av endotelin-1 (ET-1) i den indre kapselen ^6-9. Likevel krever arterie okklusjon forsiktig disseksjon av blodårene, men den produserer et bredt spekter av infarkt lesjon, herunder den interne kapsel, uten vedvarende atferds underskudd. Videre ET-en var ikke diffust å fullstendig ødelegge den bakre lem av den interne kapselen, og dermed mindre markert eller vedvarende behavioral underskudd.

En photothrombotic infarkt modell har blitt mye brukt for å generere ulike typer av infarkt lesjoner i cortex og subkortikale strukturer ^10. Teknikken inkluderer intravenøs administrering etterfulgt av fokal belysning, noe som fører til blodplateaggregasjon i de små fartøyer og generering av infarkt lesjoner ^10. Photothrombotic teknikken har blitt mye brukt til å lage GMS lesjoner, mens det har sjelden blitt brukt til å generere WMS lesjoner ^5,11. For denne teknikken, har en kombinasjon av Rose Bengal fargestoff og lysbestråling blitt vist å være anvendbare i ødeleggelse av målstrukturen, forårsaker tilsvarende funksjonsproblemer. Hovedelementet i photothrombotic teknikken er lys bestråling, fordi den bestemmer størrelsen på infarkt lesjoner. Lys bestråling gir ulike effekter på små grå og hvit substans, fordi spredning av lyset er mer enn 4 ganger høyere i hvitt matter sammenlignet med grå materie ^12; Følgelig, hvis lysintensiteten har en tilstrekkelig lav irradians (<1,140 mW / mm ^2), kan man begrense utvidelsen til hvilken photothrombotic lesjon påvirke graden til hvit substans (f.eks., Intern kapsel). For eksempel kan lys av høyere energi indusere infarkter i både grå og hvit substans, men likevel lavere energilampen kan indusere photothrombosis bare i hvit substans. Videre penetrasjon av lysenergien var svært begrenset. Omtrent 99% av lysenergien som gikk tapt utover 1 mm fra lyskilden ^13. Derfor er det forventet at nøyaktig målrettet, induserer lavere energilampen photothrombosis bare i hvit substans med en minimal inngrep av nabo grå materie.

Her beskriver vi en ny fremgangsmåte for å skape infarkt lesjoner i forbena område av den indre kapsel i gnagere. Vi beskriver metoden for identifisering av forbena område i det indre ca.psule, teknologien for lysbestråling, herunder justering og levering av lys, og generering av en infarkt lesjon. Vi beskriver også atferdstesting for å vurdere fullstendigheten av kapsel modellering.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer i Gwangju Institute of Science and Technology (GIST), og alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved GIST. 1. Pre-lesioning Steps Identifikasjon av forbena området i det indre Capsule med AAV-GFP Hus og håndtere Sprague Dawley rotter (~ 400 g, 11 – 13 uker) i samsvar med institusjonelle og nasjonale retningslinjer. Steriliser alle kirurgiske verktøy og elekt…

Representative Results

Metoden som presenteres her er ment å skape en omskrevet kapsel infarkt med en vedvarende motor underskudd. Derfor er det viktig å bestemme korrekt målet innen den interne kapselen i pre-kirurgi trinn. Den somatotopic kartlegging av pyramidale fibrene i indre kapselen er ikke avgjort ennå. For å identifisere målet korrekt i det indre kapselen, må forbena område være avgrenset. En injeksjon av AAV-GFP til forbena område av motor cortex kan spore aksoner i de pyramidale fibrene i…

Discussion

Kapsel infarktet modellen presenteres her demonstrerer en målrettet lesjon med markert og vedvarende motor svekkelse i forbena funksjon. Tidligere modeller av subcortikal kapsel slag har vist en utilstrekkelig grad av motorfunksjon og en rask utvinning prosessen ^6,8,9. I denne forstand, ligner denne modellen de kliniske kapselinfarkt tilfeller som viser langsiktig funksjonstap.

De mest kritiske trinn i utviklingen av en omskrevet kapsel infarkt modellen er: 1) for å korrekt iden…

Materials

DC Temperature controller	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.	ATC1000
Digital Stereotaxic Instruments	STOELTING CO.	51900
Electrical Stimulator	CyberMedic Corp.	EMGFES 2000
Epoxy	Precision Fiber Products, INC.	PFP-353ND1	Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight  Curing Schedule: 1 minute @150°C 2~5 minutes @120°C 5~10 minutes @100°C 15~30 minutes @80°C
Fiber Optic Scribe	THORLABS, INC	S90R
Fiber patch cable	KOREA OPTRON Corp.		Outer diameter: 3mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m
Laser Power Supply	CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD.	MGL-FN-532nm-200mW-14010196
Crimp ring	DAWOOTECH CO.,LTD.		Length: 19mm Inner diameter: 3mm Outer diameter: 3.8mm Material: SUS
Micro4-micro syringe pump controller	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC	95100
Optical Power Meter	THOLABS, INC	PM100D
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH CO. LLC.	P6148
Diamond lapping (polishing) sheet	THORLABS, INC	LF3D	Grit : 3 µm
Diamond lapping (polishing) sheet	THORLABS, INC	LF6D	Grit : 6 µm
Rose Bengal	SIGMA-ALDRICH CO. LLC.	330000
Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle)	B.BRAUN MELSUNGEN AG	4502027	Size: 27G Length: 88mm Needle: 0.40mm
Waterproof sandpaper	DEERFOS CO.,LTD	CC261	Grit : 1000 µm
Nanofil 10uL syringe	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC	NANOFIL
Nanofil 33G BVLD needle	WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC	NF33BV-2
AAV-GFP virus	UNC Vector Core	AAV2-CamKIIa-eYFP	2×10^12 virus molecules/ml
Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction	Life Technologies, INC	A11122	primary antibody (1:200)
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Life Technologies, INC	A11034	secondary antibody (1:500)
Ceftezole	GUJU Pharma CO.,LTD.	A27802741	0.1%, 1ml
Lidocain hydrochloride injection	JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD.	A04900271	2%, 1ml
Hand Piece Drill	Seshin
Digital optical power and energy meter	THORLABS, INC	PM100D
Ketopropen	UNIBIOTech