Descrevendo um regulamento Dependente Fator de Transcrição do MicroRNA transcriptoma
Summary
Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.
Abstract
Enquanto a regulação da transcrição de genes codificadores de proteínas foi extensivamente estudado, pouco se sabe sobre a forma como factores de transcrição envolvidos na transcrição de ARN não-codificantes, especificamente de microARNs. Aqui, propomos uma estratégia para estudar o papel potencial do fator de transcrição na regulação da transcrição de microRNAs usando dados publicamente disponíveis, recursos computacionais e dados de alto rendimento. Nós usamos a assinatura epigenética H3K4me3 para identificar promotores de microRNA e cromatina imunoprecipitação (CHIP) dados -sequencing do projeto ENCODE para identificar promotores de microRNA que são enriquecidos com sítios de ligação de factor de transcrição. Por células de interesse com shRNA alvo um factor de transcrição de interesse e submetendo as células a matriz microRNA transfecção, estudamos o efeito deste factor de transcrição sobre o transcriptoma microRNA. Como exemplo ilustrativo usamos nosso estudo sobre o efeito da STAT3 no transcriptoma microRNA de ly crônicaleucemia mphocytic (CLL) células.
Introduction
MicroRNAs são endógenos RNAs reguladores não codificação pequenas que normalmente funcionam como reguladores negativos de expressão do mRNA ao nível pós-transcricional. Aproximadamente 1000 não codificadora de 20 a 25 nucleótidos de comprimento microARNs são encontrados no genoma humano 1,2. MicroRNAs regular a expressão do gene através de emparelhamento de bases entre a sequência canónica de sementes do microARN e a sua sequência complementar jogo semente, que é normalmente localizado na região 3 'não traduzida (UTR) dos mRNAs alvo. Colectivamente, microARNs regular mais de 30% dos genes codificadores de proteínas 3, mas apenas pouco se sabe sobre a transcrição a partir de ADN de microARNs. Tem sido sugerido que a regulação da transcrição microARN é semelhante à do ARNm de 4,5. Em particular, semelhante à sua actividade na promoção da transcrição de genes codificadores de proteínas, factores de transcrição são pensados para activar a transcrição de microARNs 6. Factor de transcrição-microRNA interação tem sido relatada como um fator modulador da expressão do gene 7, e podem também formar feed-back e loops de feed-forward. Por exemplo, Yamakuchi et ai. Relataram um circuito de retroalimentação em que p53 induz a expressão de microRNA34a, que por sua vez inibe a tradução do SIRT p53 repressor e aumentando desse modo a actividade de p53 8.
Considerando que exemplos específicos de expressão dependente de factor de transcrição de microARNs têm sido relatados, um método aceite, o qual fornece informações sobre a forma como um factor de transcrição de interesse regula a expressão do microRNA-transcriptoma é inexistente. O objectivo do protocolo aqui sugerida é a de fornecer uma descrição detalhada da transcrição dependente de factor de regulação do microARN-transcriptoma. Ao combinar os dados publicamente disponíveis, ferramentas de bioinformática e utilizando tecnologia de microarray, os pesquisadores que seguem este algoritmo seria capaz de capturar em uma escala genômica como qualquerfactor de transcrição de qualquer tipo de células de interesse regula a expressão do microRNA-transcriptoma e para explorar uma contribuição putativo do factor de transcrição-regulação da expressão de ARNm em microARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
O mecanismo subjacente a ARN polimerase II dependente de transcrição de genes codificadores de proteínas tem sido extensivamente estudada. Embora estes elementos constituem apenas 1% – 2% do genoma humano, a evidência do projecto CODIFICAR sugerem que mais de 80% do genoma humano podem ser submetidos a transcrição 17 e que regula a transcrição dos elementos de ADN não codificantes permanece largamente desconhecido 6 .
Vários estudos, o que indicava que Pol II …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação CLL Global Research. A Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center é apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde através de um Centro de Suporte Grant Câncer (P30CA16672).
Materials
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
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