Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em> In Utero</em> A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse
Summary
This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.
Abstract
In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.
Introduction
Desde a primeira descrição em 2001 por três grupos independentes 1-3 i n útero electroporação tornou-se uma ferramenta padrão amplamente utilizado para analisar a expressão génica no sistema nervoso central de roedores. Em comparação com a geração de camundongos knockout, que é, apesar de técnicas de melhoria contínua, ainda que consome tempo e dinheiro, os apelos in utero eletroporação, devido à sua simplicidade. Então, in utero eletroporação permite gain- rápido e eficiente e perda de função estudos 4.
Para transfectar as regiões cerebrais, a solução contendo o plasmídeo carregado negativamente é injectada num ventrículo. Durante o pulso eléctrico, o DNA carregado negativamente migra em direcção ao pólo positivo e, por conseguinte, a região transfectadas podem ser seleccionadas simplesmente alterando a posição do pólo positivo. Tem sido frequentemente demonstrado que várias regiões do sistema nervoso central pode ser TArgeted 3,5-8. Por exemplo, estudos recentes mostram transfecções específicos do hipocampo, córtex piriforme ou o estriado 9-11. No entanto, as informações sobre as posições adequadas são muitas vezes apenas mal padronizados e nem sempre são fáceis de transferir para diferentes linhagens de camundongos.
A transfecção de certos estágios embrionários está longe de ser trivial. Muitos fatores influenciam deve ser levado em consideração ao escolher o set-up para específica in utero eletroporação. Em primeiro lugar, para transfectar de forma otimizada as respectivas fases embrionárias, é necessário o conhecimento sobre as tensões apropriadas. Altas tensões diminuir a taxa de sobrevivência, enquanto que baixas voltagens reduzem a eficiência de transfecção 2,3,12. Também o tamanho da pá eletrodo desempenha um papel crucial, porque o uso de pás de eletrodos que são demasiado grandes resultados em menor especificidade ou podem causar a morte devido ao carinho do ritmo cardíaco 4,12,13. O aplicadatensão e do tamanho e da posição do eletrodo de remo são as características mais importantes a considerar, mas também há outros fatores que influenciam o resultado da eletroporação, como a quantidade aplicada de solução de DNA.
Nós desenvolvemos um protocolo detalhado que permite a transfecção rápido e eficiente de várias regiões do cérebro de C57BL / 6 rato 12. Neste protocolo de informação detalhada sobre as tensões para ser usado e o tamanho do eléctrodo de pá para uma maior especificidade é fornecido. Além disso, as informações sobre o ventrículo para ser preenchido, juntamente com as recomendações para a quantidade de solução de plasmídeo e a posição do eléctrodo é fornecido. A indicação das informações de posição detalhada em um mapa e de uma maior visualização destas posições permite específica simples e eficiente in utero eletroporação do córtex retrosplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme t,cornu Ammonis ele 1-3, o giro denteado, o estriato, o núcleo septal lateral, no tálamo e hipotálamo.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).
Materials
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
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