Den bm12 Inducerbar Model af systemisk lupus erythematosus (SLE) i C57BL / 6-mus
Summary
The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.
Abstract
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.
Introduction
Systemisk lupus erythematosus (SLE) er en kompleks autoimmun sygdom karakteriseret forbilledet af anti-nukleare antistof (ANA) produktion og glomerulonephritis. Talrige andre følgetilstande, herunder dermal, hjerte-lunge og leverlæsioner er forbundet med sygdom hos nogle personer. Skøn over udbredelsen i USA varierer meget, fra 150,000-1,500,000 1,2, med særlig høj forekomst hos kvinder og minoriteter 3. Selvom ætiologien af SLE har været vanskeligt at få øje på, menes det at opstå fra samspillet mellem forskellige genetiske og miljømæssige faktorer, som kulminerer i systemisk autoimmunitet.
Talrige dyremodeller har været ansat til at studere faktorer, der fører til sygdomsdebut og progression. Klassiske musemodeller for SLE omfatter genetisk disponerede musestammer herunder NZB x NZW F1 modellen og dens NZM derivater, MLR / lpr-stamme, og BXSB / Yaa stamme og inducerbare systemer, såsom pristane og kronisk graft-versus-host-sygdom (cGVHD) modeller 4. Tidlige rapporter om autoantistofproduktion i GVHD modeller anvendt forskellige musestammer eller hamster stammer til forældre i F1 overførsler 5 – 8; mere almindelige metoder, der anvendes til at studere lupus-lignende sygdom omfatter i øjeblikket DBA / 2 forælder → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, og bm12 overføringsmodel beskrevet her. Hver model har sine egne forbehold, men de generelt deler et fælles sæt af funktioner, der korrelerer med de kliniske funktioner i human sygdom. De oftest rapporterede parametre i musemodeller omfatter splenomegali, lymfadenopati, nephritis, ANA produktion og på celleniveau, udvidelse af T follikulære hjælperceller (TFH), kimcenter (GC) B-celler og plasmaceller.
Den inducerbare bm12 model opnås ved adoptiv overføring af lymfocytter fra IA bm12 B6 (C) – H2 – Ab1 bm12 / KhEgJ (bm12) mus, en stamme identical til C57BL / 6 undtagen 3 aminosyresubstitutioner på MHC klasse II, i IA b C57BL / 6 (B6) -mus. Alloaktivering af donor CD4 T-celler ved modtagerens APC'er fører til cGVHD med symptomer ligner SLE. Specifikt omfatter disse udvidelse af donorafledte TFH, udvidelse af modtagerens-afledte GC B-celler og plasmaceller, og produktion af Anas herunder anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti-chromatin og anti-RBC-antistoffer 9. Over tid, recipientmus udvikle glomerulonephritis i forbindelse med IgG indskud i den glomerulære, interstitiel, og vaskulære områder i nyrerne 10. Vi har for nylig vist, at i lighed med human sygdom, er der også en kritisk rolle for type I IFN i denne model 11. Især de definerer kriterier for human SLE omfatter udvikling af nephritis kompatibel med SLE i nærvær af anti-dsDNA-antistoffer 12, som begge er fremtrædende træk ved denne musemodel.
Der er seVeral fordele ved bm12 model over de spontane modeller. Klassiske modeller, der udvikler SLE-lignende tegn spontant afhængige af enten hybride musestammer, indavlede musestammer ikke på B6 baggrund, eller store genetiske loci på B6 baggrund, som gør passerer til knockout eller på anden måde genetisk modificerede mus vanskeligt og tidskrævende. Med bm12 inducerbare model, kan genetisk modificerede mus tjene som enten donor eller modtager, mulighed for en hurtigere identifikation af det cellulære rum, hvor bestemte gener kan være vigtige for sygdommen. Desuden udvikling sygdom i bm12 model er meget hurtigere, kræver kun 2 uger, indtil fremkomsten af Anas, i forhold til flere måneder for de fleste spontane modeller. Endvidere i modsætning til de spontane modeller, der udvikler sygdommen på forskellige tidspunkter, sygdommens indtræden og progression i bm12 → B6 model er stærkt synkroniseret. Dette muliggør generering af passende størrelse kohorter, der kan Be bruges til interventionelle eller terapeutiske strategier på ethvert stadium af udviklingen sygdom.
Hvad der følger er en detaljeret protokol for at indlede SLE-lignende autoimmunitet ved adoptiv overførsel af bm12 lymfocytter i C57BL / 6 mus, eller genetiske varianter på B6 baggrund. Derudover beskriver vi en flowcytometrisk farvningsprotokollen for optælle TFH, GC B-celler og plasmaceller-celletyper forbundet med human sygdom. Det er vigtigt, kan disse protokoller også anvendes til at karakterisere sygdommen i de fleste musemodeller for SLE og identificere TFH, GC B-celler og plasmaceller i andre sygdomsmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den bm12 inducerbar model er en forholdsvis let og effektiv måde at studere cellulære og molekylære processer i SLE. Kronisk aktivering af adoptivt overført CD4 T-celler rettet mod selv-antigener fører til akkumulering af TFH, GC B-celler og plasmaceller, som kan måles ved flowcytometri som beskrevet her. Fremtidige studier under anvendelse af denne model kan hurtigt og nemt interrogere rolle kandidatgener og nye terapier i autoimmune kimcenter processer, der ligner dem, der forekommer hos patienter med SLE, og i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (to E.M.J.), and the Albert J. Ryan Fellowship (to J.K.). We are grateful for the support and instrumentation provided by the Research Flow Cytometry Core in the Division of Rheumatology at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, supported in part by NIH AR-47363, NIH DK78392 and NIH DK90971.
Materials
| B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1+ BoyJ mouse strain |
| B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | Bm12 mouse strain |
| FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Restriction digest enzyme for genotyping |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
| Plasma Separation Tube (PST) | BD | 365974 | Blood collection tube with Dipotassium EDTA |
| Serum Separation Tube (SST) | BD | 365967 | Blood collection tube with Clot activator / SST Gel |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | High density cell separation solution |
| Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | High density cell separation solution |
| GL-7-biotin | eBioscience | 13-5902-82 | |
| Streptavidin-BUV395 | BD | 564176 | |
| CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
| CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
| TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
| CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
| CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
| PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
| CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
| Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
| CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
| Fixable Viability Dye ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
| CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
| 1.2 ml FACS tube inserts, racked | USA Scientific | 1412-1400 | |
| BD Falcon™ Round-Bottom Tubes | BD | 352017 |
References
- Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
- Somers, E. C., Marder, W., et al. Population-based incidence and prevalence of systemic lupus erythematosus: The Michigan lupus epidemiology and surveillance program. Arthritis and Rheumatol. 66, 369-378 (2014).
- Perry, D., Sang, A., Yin, Y., Zheng, Y. -. Y., Morel, L. Murine models of systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2011, 271694 (2011).
- Lindholm, L., Rydberg, L., Strannegård, O. Development of host plasma cells during graft-versus-host reactions in mice. Eur J Immunol. 3 (8), 511-515 (1973).
- Fialkow, P. J., Gilchrist, C., Allison, A. C. Autoimmunity in chronic graft-versus-host disease. Clin Exp Immunol. 13, 479-486 (1973).
- Streilein, J. W., Stone, M. J., Duncan, W. R. Studies on the Specificity of Autoantibodies Produced in Systemic Graft-vs-Host Disease. J Immunol. 114 (1), 255-260 (1975).
- Gleichmann, E., Gleichmann, H. Diseases caused by reactions of T lymphocytes to in compatible structures of the major histocompatibility complex. I. Autoimmune hemolytic anemia. Eur J Immunol. 6 (12), 899 (1976).
- Morris, S., Cohen, P. L., Eisenberg, R. Experimental induction of systemic lupus erythematosus by recognition of foreign Ia. Clin Immunol Immunopathol. 57 (2), 263-273 (1990).
- Chen, F., Maldonado, M., Madaio, M., Eisenberg, R. The Role of Host (Endogenous) T Cells in Chronic Graft-Versus-Host Autoimmune Disease. J Immunol. 161 (11), 5880-5885 (1998).
- Klarquist, J., Hennies, C. M., Lehn, M. A., Reboulet, R. A., Feau, S., Janssen, E. M. STING-Mediated DNA Sensing Promotes Antitumor and Autoimmune Responses to Dying Cells. J Immunol. 193, 6124-6134 (2014).
- Petri, M., Orbai, A. -. M., et al. Derivation and validation of systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 64 (8), 2677-2686 (2012).
- Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- . Product information: Thermo Scientific FastDigest PsuI Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/MAN0012567_FastDigest_PsuI_UG.pdf (2012)
- Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. J Vis Exp. (7), e265 (2007).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
- Covelli, V. Chapter 3, Internal examination. Guide to the necroscopy of the mouse. , (2009).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. (44), e2259 (2010).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), e53319 (2007).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), e2771 (2012).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- Cohen, M., Varki, N. M., Jankowski, M. D., Gagneux, P. Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution. J Vis Exp. (67), e3928 (2012).
- Cohen, P. L., Maldonado, M. A. Animal models for SLE. Curr Protoc Immunol.. Chapter 15, Unit 15.20 (2003).
- Seavey, M. M., Lu, L. D., Stump, K. L. Animal models of systemic lupus erythematosus (SLE) and ex vivo assay design for drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 5, Unit 5 (2011).
- McKenna, K. C., Vicetti Miguel, R. D., Beatty, K. M., Bilonick, R. A. A caveat for T cell transfer studies: generation of cytotoxic anti-Thy1.2 antibodies in Thy1.1 congenic mice given Thy1.2+ tumors or T cells. J Leukoc Biol. 89 (2), 291-300 (2011).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., et al. Identification of a mouse male-specific transplantation antigen H-Y.. Nature. 376, 695-698 (1995).
- Joly, E., Hudrisier, D. What is trogocytosis and what is its purpose. Nat Immunol. 4 (9), 815 (2003).
- Brown, D. R., Calpe, S., et al. Cutting edge: an NK cell-independent role for Slamf4 in controlling humoral autoimmunity. J Immunol. 187 (1), 21-25 (2011).
- Morris, S. C., Cheek, R. L., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. Allotype-specific immunoregulation of autoantibody production by host B cells in chronic graft-versus host disease. J Immunol. 144 (3), 916-922 (1990).
- Choudhury, A., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. B cells require “nurturing” by CD4 T cells during development in order to respond in chronic graft-versus-host model of systemic lupus erythematosus. Clin Immunol. 136 (1), 105-115 (2010).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
