C57BL / 6マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）のBM12誘導モデル
Summary
The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.
Abstract
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.
Introduction
全身性エリテマトーデス（SLE）は、抗核抗体（ANA）の生産及び糸球体腎炎によって原型特徴複雑な自己免疫疾患です。多数の他の皮膚などの後遺症、心肺、および肝病変はいくつかの個体における疾患と関連しています。米国での有病率の推定値は、女性やマイノリティ3で特に高頻度で、150,000-1,500,000 1,2から、大きく異なります。 SLEの病因を識別することは困難であったが、それは全身性自己免疫で終わる様々な遺伝的及び環境的要因の相互作用から生じると考えられています。
多数の動物モデルは、疾患の発症と進行をもたらす因子を研究するために使用されてきました。 SLEのクラシックマウスモデルは、PなどNZWのF1モデルとそのNZM誘導体、MLR / LPR株、およびBXSB /のYaa株、および誘導系NZB Xを含む遺伝的素因のマウス系統を含み、ristaneおよび慢性移植片対宿主病（cGVHDの）モデル4。 GVHDモデルにおける自己抗体の産生の初期の報告では、F1の転送5に親のための様々なマウス系統またはハムスター株を使用– 8。ループス様疾患を研究するために使用されるより一般的な方法は、現在、DBA / 2親→（C57BL / 6×DBA / 2）F1を含み、BM12伝達モデルは、ここで説明します。各モデルは、独自の警告を持っていますが、それらは一般にヒトの疾患の臨床的特徴と相関機能の共通セットを共有しています。マウスモデルの中で最も頻繁に報告されたパラメータは、脾腫、リンパ節症、腎炎、ANAの生産、および細胞レベルで、T濾胞ヘルパー細胞（TFH）、胚中心（GC）B細胞および形質細胞の増殖が含まれます。
H2 – – Ab1のBM12 / KhEgJ（BM12）マウス、系統iは、誘導性BM12モデルは、IA BM12 B6（C）からのリンパ球の養子移入することによって達成されますIA bはC57BL / 6（B6）マウスに、MHCクラスII上の3個のアミノ酸置換を除いて、C57BL / 6にdentical。受信者APCによるドナーCD4 T細胞のAlloactivationは密接にSLEに似た症状をcGVHDのにつながります。具体的には、これらはドナー由来TFH、レシピエント由来のGCのB細胞および形質細胞の増殖、及び抗dsDNA、抗ssDNAを、抗クロマチン、及び抗RBC抗体9を含むアナスの生産の拡大を含みます。時間が経つにつれて、レシピエントマウスは、糸球体、間質中のIgG沈着、腎臓10の血管領域に関連する糸球体腎炎を発症します。我々は最近、ヒト疾患と同様に、私はこのモデル11で型IFNの重要な役割もある、ということを示しています。注目すべきは、人間SLEの定義基準は、このマウスモデルの顕著な特徴であり、どちらも抗dsDNA抗体12の存在下で、SLEと互換性腎炎の開発が含まれています。
SEがあります自発的なモデルの上にBM12モデルのveral利点。 SLEのような兆候を開発するクラシックモデルは、自然にノックアウトするために交差またはその他の遺伝的に改変されたマウスは難しく、時間がかかる行うハイブリッドマウス系統、近交系マウス系統ではないB6の背景に、またはB6の背景に大きな遺伝子座のいずれかに依存しています。 BM12誘導モデルでは、遺伝的に改変されたマウスは、特定の遺伝子が疾患のために重要であり得る、細胞コンパートメントのより迅速な同定を可能にする、ドナーまたはレシピエントのいずれかとして機能することができます。また、BM12モデルにおける疾患の発生は、ほとんどの自発的なモデルのために数ヶ月に比べ、アナスの出現まで、わずか2週間を必要とする、はるかに高速です。また、異なる時点で疾患を発症する自発的なモデルとは対照的に、BM12ー→B6モデルにおける疾患の発症および進行は非常に同期化されます。これは、bのできる適切なサイズのコホートの生成を可能にしますeは、疾患の発生の任意の段階で介入または治療戦略のために使用されます。
以下は、B6の背景に、C57BL / 6マウスにBM12リンパ球の養子移入、または遺伝的変異によって、SLEのような自己免疫を開始するための詳細なプロトコルです。さらに、我々はTFH、GC B細胞、およびヒト疾患に関連する形質細胞 – 細胞タイプを列挙するためのフローサイトメトリー染色プロトコルを記述する。重要なことは、これらのプロトコルはまた、SLEのほとんどのマウスモデルにおける疾患を特徴付ける、および他の疾患モデルでTFH、GC B細胞および形質細胞を同定するために使用され得ます。
Protocol
Representative Results
Discussion
BM12誘導モデルは、SLEの細胞および分子プロセスを研究するための比較的容易かつ効率的な方法です。自己抗原に対する養子移入CD4 T細胞の慢性的活性化は、ここで説明したように、フローサイトメトリーによって測定することができるTFH、GC B細胞および形質細胞の蓄積につながります。このモデルを使用して、将来の研究は、迅速かつ容易にSLEを有する患者において生じるものに似ている?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (to E.M.J.), and the Albert J. Ryan Fellowship (to J.K.). We are grateful for the support and instrumentation provided by the Research Flow Cytometry Core in the Division of Rheumatology at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, supported in part by NIH AR-47363, NIH DK78392 and NIH DK90971.
Materials
| B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1+ BoyJ mouse strain |
| B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | Bm12 mouse strain |
| FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Restriction digest enzyme for genotyping |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
| Plasma Separation Tube (PST) | BD | 365974 | Blood collection tube with Dipotassium EDTA |
| Serum Separation Tube (SST) | BD | 365967 | Blood collection tube with Clot activator / SST Gel |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | High density cell separation solution |
| Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | High density cell separation solution |
| GL-7-biotin | eBioscience | 13-5902-82 | |
| Streptavidin-BUV395 | BD | 564176 | |
| CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
| CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
| TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
| CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
| CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
| PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
| CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
| Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
| CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
| Fixable Viability Dye ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
| CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
| 1.2 ml FACS tube inserts, racked | USA Scientific | 1412-1400 | |
| BD Falcon™ Round-Bottom Tubes | BD | 352017 |
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