Den bm12 inducerbara Modell av systemisk lupus erythematosus (SLE) i C57BL / 6 möss

Summary

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

Abstract

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

Introduction

Systemisk lupus erythematosus (SLE) är en komplex autoimmun sjukdom som karakteriseras prototypically av antinukleära antikroppar (ANA) produktion och glomerulonefrit. Många andra följdsjukdomar, inklusive huden, hjärt-lung och leverskador är förknippade med sjukdomen hos vissa individer. Prevalensskattningar i USA varierar kraftigt, från 150,000-1,500,000 ^1,2, med särskilt hög förekomst hos kvinnor och minoriteter ^3. Även om etiologin av SLE har varit svårt att urskilja, är det tänkt att uppstå från samspelet mellan olika genetiska och miljömässiga faktorer, som kulminerar i systemisk autoimmunitet.

Många djurmodeller har använts för att studera faktorer som leder till insjuknande och progression. Klassiska musmodeller av SLE innefattar genetiskt predisponerade musstammar inkluderande NZB x NZW F1 modellen och dess NZM derivat, MLR / lpr-stam, och BXSB / Yaa-stam, och inducerbara system, såsom pristane och kronisk graft-versus-host-sjukdom (cGVHD) modeller ^4. Tidiga rapporter om autoantikroppsproduktion i GVHD modeller använt olika musstammar eller hamster stammar för förälder till F1 överföringar ^{5 – 8;} mer vanligaste metoderna som används för att studera lupusliknande sjukdom omfattar i dagsläget DBA / 2 förälder → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1 och bm12 överföringsmodell som beskrivs här. Varje modell har sina egna varningar, men de i allmänhet har en gemensam uppsättning funktioner som korrelerar med kliniska tecken på mänskliga sjukdomar. De oftast rapporterade parametrarna i musmodeller innefattar splenomegali, lymfadenopati, nefrit, ANA produktion, och på cellnivå, expansionen av T follikulära hjälparceller (TFH), germinala center (GC) B-celler och plasmaceller.

Den inducerbara bm12 modellen uppnås genom adoptiv överföring av lymfocyter från lA ^bm12 B6 (C) – H2 – Ab1 ^bm12 / KhEgJ (bm12) möss, en stam identical till C57BL / 6 med undantag för 3 aminosyrasubstitutioner på MHC klass II, i IA ^b C57BL / 6 (B6) möss. Alloactivation donator CD4 T-celler från mottagare APC leder till cGVHD med symtom nära liknar SLE. Specifikt innefattar dessa expansion av donatorhärledda TFH, expansion av mottagarens härledda GC B-celler och plasmaceller, och produktion av ANA inklusive för anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti kromatin, och anti-RBC-antikroppar ^9. Med tiden recipientmöss utveckla glomerulonefrit associerad med IgG-insättningar i den glomerulära, interstitiell och kärl regioner i njurarna ^10. Vi har nyligen visat att, i likhet med human sjukdom, finns det också en kritisk roll för typ I-IFN i denna modell ^11. Noterbart är de avgörande kriterierna för human SLE ​​omfatta utveckling av nefrit kompatibel med SLE i närvaro av anti-dsDNA-antikroppar ^12, som båda är framträdande dragen i denna musmodell.

Det finns seVeral fördelar med bm12 modell över de spontana modeller. Klassiska modeller som utvecklar SLE-liknande tecken spontant förlita sig på antingen hybrid musstammar, inavlade musstammar inte på B6 bakgrund, eller stora genetiska loci på B6 bakgrund, som gör korsar att knockout eller på annat genetiskt modifierade möss svårt och tidskrävande. Med bm12 inducerbara modellen, kan genetiskt modifierade möss fungera som antingen givaren eller mottagaren, vilket gör att mer snabb identifiering av den cellulära utrymmet där vissa gener kan vara viktigt för sjukdom. Dessutom är sjukdomsutveckling i bm12 modellen mycket snabbare, kräver endast två veckor tills utseendet på ANA, jämfört med flera månader för de flesta spontana modeller. Dessutom i motsats till de spontana modeller som utvecklar sjukdomen vid olika tidpunkter, sjukdomens debut och progression i bm12 → B6 modell är starkt synkroniserade. Detta gör det möjligt för generering av lämplig storlek kohorter som kan Be används för interventionella eller terapeutiska strategier i något skede av sjukdomsutvecklingen.

Det som följer är ett detaljerat protokoll för initiering SLE-liknande autoimmunitet genom adoptiv överföring av bm12 lymfocyter till C57BL / 6-möss, eller genetiska varianter på B6 bakgrunden. Dessutom beskriver vi en flödescytometrisk färgningsprotokollet för att räkna TFH, GC B-celler, och typer plasmaceller celler i samband med sjukdom hos människor. Viktigt, kan dessa protokoll också användas för att karakterisera sjukdom hos de flesta musmodeller av SLE och identifiera TFH, GC B-celler och plasmaceller i andra sjukdomsmodeller.

Protocol

Djur Arbetet utfördes under specifika patogenfria förhållanden i enlighet med de riktlinjer som fastställts av Föreningen för bedömning och ackreditering av försöksdjurs Care International och vår Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). OBS: Införliva möss som uttrycker en kongena markör såsom CD45.1 antingen givaren eller mottagaren djur om möjligt, eftersom det möjliggör övervakning av givar graft effektivitet och specifik expansion av donator CD4 T-…

Representative Results

Sjuka möss utvecklar splenomegali i så lite som 14 dagar, uppvisar mjälte 2-3 gånger större än friska möss när det gäller massa och cellularitet (Figur 2). Splenocyter sekventiellt gated på ljusspridning (FSC-A genom SSC-A), eliminering av dubletter (FSC-W eller -H av FSC-A), levande celler (låg färgning av lönsamheten färg) och CD4 + TCRβ + (figur 3A). Donatorceller skiljer sig från mottagarceller som bygger på CD45.1 …

Discussion

Den bm12 inducerbara modellen är ett relativt enkelt och effektivt sätt att studera de cellulära och molekylära processer i SLE. Kronisk aktivering av adoptivt överförda CD4 T-celler riktade mot självantigener leder till ansamling av TFH, GC B-celler och plasmaceller, som kan mätas med flödescytometri, såsom beskrivits här. Framtida studier med denna modell kan snabbt och enkelt förhöra roll gener och nya behandlingar i autoimmuna germinala centrum processer som liknar de som förekommer hos patienter med S…

Materials

B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ	The Jackson Laboratory	001162	CD45.1+ BoyJ mouse strain
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ	The Jackson Laboratory	001162	Bm12 mouse strain
FastDigest PsuI	Life Technologies	FD1554	Restriction digest enzyme for genotyping
1X RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4333-57
IMDM	GE Healthcare	SH30228.01
Plasma Separation Tube (PST)	BD	365974	Blood collection tube with Dipotassium EDTA
Serum Separation Tube (SST)	BD	365967	Blood collection tube with Clot activator / SST Gel
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	High density cell separation solution
Lympholyte-M	Cedarlane	CL5030	High density cell separation solution
GL-7-biotin	eBioscience	13-5902-82
Streptavidin-BUV395	BD	564176
CD138-BV421	BioLegend	142508
CD4-BV510	BioLegend	100559
TCRβ-BV605	BD	562840
CD45.1-BV711	BioLegend	110739
CD45.2-FITC	BioLegend	109806
PD-1-PE	BioLegend	135206
CD19-PerCP	BioLegend	115532
Fas-PE-Cy7	BD	557653
CXCR5-APC	BioLegend	145506
Fixable Viability Dye ef780	eBioscience	65-0865-18
CD4-BV421	BioLegend	100443
1.2 ml FACS tube inserts, racked	USA Scientific	1412-1400
BD Falcon™ Round-Bottom Tubes	BD	352017