Evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus Modellen van kwantitatieve real-time PCR

Summary

Dit protocol wordt beschreven hoe kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR) gebruikt om tumorcel specifieke mRNA die metastase in de muis longweefsel detecteren.

Abstract

Metastatische ziekte is de verspreiding van kwaadaardige tumorcellen uit de primaire kankertype naar een verre orgaan en is de primaire oorzaak van kanker-geassocieerde overlijden ^1. Voorkomende plaatsen van metastatische verspreiding omvatten longen, lymfeklieren, hersenen en bot ^2. Mechanismen die metastase rijden zijn intense gebied van kankeronderzoek. Bijgevolg effectieve assays voor uitgezaaide last te meten in verre plaatsen van metastase zijn instrumenteel voor kankeronderzoek. Evaluatie van longmetastasen in borsttumor modellen wordt in het algemeen uitgevoerd door het bruto kwalitatieve observatie van longweefsel na dissectie. Kwantitatieve evaluatie van metastasen momenteel beperkt tot ex vivo en in vivo imaging gebaseerde technieken die gebruiker gedefinieerde parameters vereisen. Veel van deze technieken zijn op het hele organisme niveau in plaats van het cellulaire niveau ^3-6. Hoewel nieuwere beeldvormende methoden gebruik te maken van multi-foton microscopie zijn in staat om metas evaluerenTasis op cellulair niveau ^7, deze zeer elegante procedures zijn meer geschikt voor het evalueren mechanismen van verspreiding dan kwantitatieve beoordeling van metastatische belasting. Hier is een eenvoudige in vitro werkwijze kwantitatief beoordelen metastase gepresenteerd. Met behulp van kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR), kan tumorcel specifieke mRNA worden gedetecteerd in de muis longweefsel.

Introduction

QRT-PCR analyse is voorgesteld als een werkwijze voor het beoordelen van tumormetastase. Deze werkwijze is voorgesteld als een alternatief voor gebruikers die geïnteresseerd zijn in de beoordeling metastase zijn slechts toegankelijk voor bepaalde apparatuur niet zoals in vivo beeldvormende apparatuur of fluorescentie staat stereoscoop. Een bespreking van de meest gebruikte methoden gepresenteerd, gevolgd door een demonstratie van hoe QRT-PCR-analyse kan worden gebruikt als een afzonderlijke of als gezelschap methode om metastase te beoordelen. Deze procedure heeft het potentieel om een ​​kwantitatieve analyse van metastatische belasting verschaffen.

Standaardmethoden van de bruto-analyse, met inbegrip van visualisatie van de longen onder een stereomicroscoop evenals seriële snijden, gevolgd door hematoxyline en eosine (H & E) kleuring van longweefsel, kwantificeerbaar zijn maar sterk afhankelijk van door de gebruiker gedefinieerde parameters voor het tellen van ^2-5. Bij de evaluatie van hele longen met behulp van een stereomicroscoop, alleen grote oppervlakte uitzaaiingen zijn visible en analyse vereist de onderzoeker om een ​​redelijke kennis van de long anatomische structuur te bepalen wat een metastatische laesie te hebben. Fluorescentielabelling van tumorcellen met een merker zoals GFP en het gebruik van een stereomicroscoop met een lichte kubus met de geschikte excitatie- / emissie maxima (bijv nabij 470/510 nm voor GFP) bevat helpt bij dit proces, maar alleen aan de oppervlakte tumornoduli detecteerbaar . Bovendien fluorescentie van bloed verontreinigingen, die zichtbaar worden onder dezelfde parameters als GFP is, kan leiden tot vals identificeren van mogelijke metastatische laesies.

Snijden van de long, gevolgd door H & E kleuring long metastase visualiseren is een nuttige methode om micrometastasen en andere microscopische processen zoals immune infiltratie te evalueren, maar het gebruik van de gehele long weefsel voor inbedden in paraffine, snijden en kleuringen vereist vaak. Daarom stroomafwaartse procedures niet ideaal na deze method. Hoewel kwantificeerbaar, vereist deze procedure de onderzoeker een groot aantal gekleurde longsecties per dier evalueren om te garanderen dat de analyse rekening voor de gehele 3D-structuur van de longen. Bijgevolg is dit type onderzoek is tijdrovend, kan leiden tot het tellen fout, en analyse leunt zwaar op de onderzoeker discretie.

Verscheidene in vivo beeldvormende technieken (bijvoorbeeld MRI, PET, SPECT) worden momenteel gebruikt uitvoeren of testen biologische processen in experimentele diermodellen ^8. Bioluminescentie beeldvorming is een gemeenschappelijke methode om een bruto weergave van metastase ⁹ verwerven. Deze techniek wordt algemeen op de aanwezigheid van luciferase-reporter-activiteit te evalueren als gevolg van de accumulatie van tumorcellen die zijn ontworpen om een ​​luciferase responselement bevatten, die in bepaalde organen zoals de melkklier na tumorcel implantatie en de longen op spontane metastase verblijven ¹0. Visualisatie van luciferase-activiteit wordt geïnduceerd door de aanwezigheid van luciferine substraat (D-luciferine). Luciferase katalyseert de oxidatieve decarboxylering van D-luciferine tot oxyluciferine genereren bioluminescentie. Terwijl informatief, is deze werkwijze beperkt door verscheidene factoren, waaronder substraat stabiliteit (bijv korte halfwaardetijd), adequate verdeling van substraat hangt af van hoe het wordt geleverd aan proefdieren en lage detectiegevoeligheid ^9. Een belangrijke verdienste van deze techniek is dat het niet-invasief kan worden uitgevoerd op levende dieren, en kan leiden tot de detectie van tumorcellen metastasen in meerdere organen die niet zijn normaliter geoogst dissectie ^9,10.

Een positief aspect van in vivo imaging technieken is dat het longweefsel wordt ongestoorde waardoor secundaire procedures zoals paraffine inbedding of zoals hier gepresenteerd, QRT-PCR-analyse. Omdat QRT-PCR theoretically een gevoeligere maat voor detectie bruto evaluatie niet gering aantal tumorcellen in de long zichtbaar. Hoewel nuttig, kan de beeldvormende technieken hierboven beschreven gesubstitueerd of aangevuld met QRT-PCR methode die momenteel beschreven. QRT-PCR heeft het potentieel om een ​​gevoelige maatstaf van tumor afgeleide mRNA binnen een long.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen en verzorging van dieren normen van de Medische Universiteit van Zuid-Carolina (MUSC) en de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Lung Dissection Borsttumor dissectie (optioneel afhankelijk van de studie doelen en of de primaire tumor analyse of staartader injectie werd uitgevoerd). Euthanaseren muis met behulp van een dodelijke dosis van isofluraananesthesie volgens IACUC en universitaire regelgeving. Bevestig euthanization door chirurgisch…

Representative Results

Voorbij de tijd die nodig is om de initiële inoculatie van tumorcellen te voeren in het proefdier en zo uitvoeren, de primaire tumor in vivo analyse van het weefsel oogst, RNA-isolatie en QRT-PCR analyse een 1-2 dagen procedure (figuur 1) . Een voorbeeld van grove analyse bioluminescentie beeldvorming tumorcellen te evalueren in het longweefsel. Hier werd een borstklier tumorgenese experiment uitgevo…

Discussion

Dit protocol beschrijft het gebruik van QRT-PCR om mammaire tumorcelmetastase evalueren aan de longen met een xenograft muismodel. Er wordt erkend dat andere technieken, zoals bioluminescentie beeldvorming, zijn beschikbaar en zijn ook effectief voor het detecteren van metastasen ondanks hun eigen waarden en beperkingen. De gepresenteerde gegevens suggereren dat QRT-PCR een effectieve maatregel detecteren tumor afgeleide mRNA in longweefsel voor kwantificering van totaal metastase. Voorgesteld wordt QRT-PCR analyse een …

Materials

2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG