Introduction
Införsel av influensa A-virus (IAV) är en flerstegsprocess som börjar med bindningen av viruset till receptorer på plasmamembranet av målceller 1. Receptorn för IAV är sialinsyra som är närvarande på en stor variation av glykoproteiner och glykolipider. Hemagglutinin (HA) -protein av IAV som är närvarande i det virala höljet binder till sialinsyra och därigenom medierar infästning av de virala partiklarna till plasmamembranet i målceller 2. Viruset kommer in i celler via clathrin medierad endocytos, utan även alternativa inträdesvägar, såsom macropinocytosis, har beskrivits 3-6. Interaktionen mellan HA och sialinsyra verkar vara tillräcklig för att mediera både, fastsättning och trigginternalisering av virala partiklar 7. Ändå har alternativa inträdes receptorer föreslagits och deras roller i IAV post är för närvarande utreds 1,8,9.
USLINGrande, görs insatser för att identifiera värdfaktorer som är inblandade i den virala livscykeln med syfte att utveckla angelägna nya antivirala terapier 10-12. Virus inträde skulle vara en gynnsam steg för att rikta IAV tillväxt för att blockera virusinfektion i sin tidigaste punkten. Att mäta olika stadier av IAV posten experimentellt är utmanande som vanligt stora mängder virus är skyldiga att upptäcka inkommande virus. Dessutom är detektionsområdet för förändringar i virus artikel enbart linjär på grund av bristen av viral replikation. Detta understryker behovet av analyser med hög känslighet.
Analysen vi presenterar här tillåter detektion av bifogade virus vid cellytan samt upptäckt av intern virus i förhållande till den totala mängden av cellassocierade virus. Användningen av biotinylerade vildtyp-virus som ger enkel mätning genom färgning med STV-Cy3 och avläsning med flödescytometri. Biotinylerad virus är kall bundet till cells för att tillåta fastsättning men hindrar internalisering av viruspartiklar. Celler kan fastställas, permeabilized och färgades med STV-Cy3 att mäta bifogas virus. Signalen från extracellulära, bifogade virioner kan upphävas om en blockerande steg appliceras innan fixeringen i vilket cellerna odlas med icke-märkt streptavidin (STV). I ett nästa steg, efter bindning av biotinylerad IAV, är temperaturen skiftas till 37 ° C och internalisering av virala partiklar tillåts äga rum. Internaliserade partiklar är skyddade från bindning av STV varigenom diskriminering mellan extra- och intracellulära virus.
Per experimentell tillstånd, fyra prover som krävs: "0 min": Det första provet, märkt "0 min", är att mäta kallbundet virus på cellytan. "0 min + STV: Det andra provet, märkt" 0 min + STV ", ger baslinjen signalstyrkan i experimentet. Bifogat viruset är blockerad with STV och signalen efter färgning med STV-Cy3 borde vara mycket lägre jämfört med "0 min" prov. '30 Min ": Det tredje provet, '30 min" innehåller fast och intern virus på grund av temperaturförändringen till 37 ° C under 30 minuter. '30 Min + STV: Den fjärde provet, '30 min + STV "åtgärder den intracellulära fraktionen av virus. STV blockeringssteg appliceras efter 30 minuters inkuberingsperiod. Som ett resultat, är virala partiklar vid cellytan bundna av STV lämnar endast internaliserade virus tillgängligt för färgning med STV-Cy3. Den relativa mängden av intern virus kan beräknas som förhållandet mellan intern virus (mätt i '30 min + STV "prov) delat med den totala mängden virus (beskrivs av '30 min" prov).
Som kontroller föreslår vi att inkludera skeninfekterade celler. Signalen följer STV-Cy3 färgning av skeninfekterade celler ger bakgrundenföljd av färgningsprotokollet. En kontroll för IAV fastsättning är förbehandling av celler med bakterie neuraminidas (NA). NA klyver av sialsyra från cellulära glykoproteiner, därigenom avlägsna fäst receptorer från cellytan. Natriumazid (SA) är ett potent ämnesomsättnings hämmare och därmed blockerar endocytos 13. Celler behandlade med natriumazid bör vara positivt för virusbindning men negativ för internalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Observera före start: Använd laminärt flöde huva och lämplig biologisk inneslutning när man arbetar med levande virus. Här beskriver vi tillväxtbetingelser är lämpliga att odla influensavirusstammen A / WSN / 33. Infektionsmultiplicitet (MOI) och inkubationstider kan variera beroende på virusstam som används.
1. Framställning av biotinylerat A / WSN / 33 Virus
- Seed Madin-Darby Canine kindey (MDCK) celler till en T175 cm 2 kolv med användning Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin (Pen / Strep). Odlingsceller vid 37 ° C tills cirka 70% konfluens uppnåtts.
- Före infektion, ta bort mediet och tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH7.0-7.3) genom tillsats av en tillräckligt stor volym för att täcka cellmonoskiktet.
- Ta bort PBS och infektera celler med A / WSN / 33 med en MOI på 10 -4. Späd viruset i PBS kompletterad med 0,02 mg Mg 2+, 0,01 mg Ca2 + </ sup>, 0,3% bovint serumalbumin (BSA), och 1% pen / strep (infektion-PBS). Använd en ymp av 4 ml för en T175 cm 2 kolv.
- Inkubera cellerna 1 h vid 37 ° C. Avlägsna inokulum genom aspiration och pipett 10 ml DMEM kompletterat med 0,3% BSA, 20 mM HEPES, och en% Pen / Strep i kolven.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C under ca 3 dagar tills cytopatisk effekt (CPE) är synlig, och därefter skörd supernatanten. CPE kan erkännas som avrundning av celler följt av avskildhet och död av celler 14.
- Spin supernatanten vid 450 xg under 5 minuter för att avlägsna cellrester. Överför supernatanten till ett nytt falk rör och upprepa detta steg en gång. Kasta pellets.
- Överför supernatanter till ultracentrifugrör och underlags supernatanter med 5 ml 30% sackaros utspädda i NTE-buffert (10 mM tris [pH 7,4], 100 mM NaCI, 1 mM EDTA). Balans rören innan ultracentrifugering och fyll upp med PBS för att nå en slutvolym på 30 ml. Spin supernanare vid 112.398 xg (motsvarande 25 tusen varv per minut under en SW28 rötor) under 90 min i en ultracentrifug.
- Försiktigt bort supernatanten genom pipettering och njuta viruspelleten natten vid 4 ° C i 250 pl PBS. Återsuspendera pelleten genom att pipettera upp och ned. Mät proteinhalt av renat virus genom Bradford-analys 15.
- Använd en biotinylation kit för att generera biotinylerat A / WSN / 33. Följ tillverkarens anvisningar.
- I korthet, tillsätt lämplig mängd av biotin till det renade viruset och inkubera i 2 h på is. Överför virus till ett ultracentrifugrör och fyll röret med PBS för att nå en slutvolym på 30 ml. Spin virus vid 112.389 xg under 90 min i en ultracentrifug. Avlägsna supernatanten genom pipettering och tillsätt 250 pl PBS. Blöt pellet över natten vid 4 ° C. Alikvotera och lagra den biotinylerade viruset lagrades vid -80 ° C, där det kommer att vara stabil under minst 24 månader.
OBS: Det kan vara till hjälp för att bestämma titer av biotinylerade preparation av IAV med standardplackanalys. Emellertid bör det noteras att den efterföljande protokollet endast kommer att mäta biotinylerade viruspartiklar. Återstående icke biotinylerade partiklar på grund av ofullständig biotinylering kommer att bidra till den infektiösa titem genom plackanalys, men inte till signalen uppmätt i in- / interna analysen.
2. Bestäm den önskade mängden av biotinylerat Virus
OBS: Före in- / interna analys utförs, är det viktigt att bestämma den mängd biotinylerad viruset som krävs för att infektera alla celler i ett prov.
- Kultur och trypsinize A549-celler enligt tillverkarens instruktioner. Räkna cellerna med användning av en cellkammare. Pipettera 200 tusen A549-celler in i FACS-Deepwell rör. Spin 3 min vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med 200 pl PBS. Cool celler nedåt på is under 10 min.
- Bered 5-faldiga serieutspädningar av biotinylated virus lager i infektions PBS.
- Spin rör innehållande av cellerna vid 4 ° C under 3 min vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med 100 ul virusinnehållande infektions PBS. Som håna kontroll användning infektions PBS utan biotinylerad virus. Inkubera rören på is under en timme.
- Spin rören vid 4 ° C under 3 min vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 pl PBS. Upprepa detta steg en gång.
- För fixering, spinn rören vid 4 ° C under 3 minuter vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 | il 3,7% paraformaldehyd (PFA). Inkubera i 10 min vid RT. Upprepa sedan tvättsteg som beskrivs i 2.4).
- För permeabilisering, spinn rören vid 4 ° C under 3 minuter vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 | il PBS innehållande 0,5% Triton X-100. Inkubera under 6 min vid RT. Upprepa sedan tvättsteg som beskrivs i 2.4).
- Spin rören vid 4 ° C under 3 min vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pellet i 50 pl 2% BSA utspädd i PBS innehållande STV-Cy3. (Observera, bör lämplig koncentration av STV-Cy3 bestämmas innan försöket Börja med en koncentration av 1:. 200 och test 2-faldiga utspädningar upp till 1:. 2400 I våra händer, en utspädning av 1: 1000 bevisade vara optimal.)
- Inkubera 1 timme i mörker vid RT. Sedan upprepar tvättsteg som beskrivs i 2.4 men suspendera pelleten i 200 pl 2% BSA utspädd i PBS.
- Analysera prover med flödescytometri 16. Gate på Cy3 positiva populationen. Välj den lägsta koncentrationen av biotinylerad virus som resulterar i det maximala antalet Cy3-positiva celler i A549 befolkningen.
3. Bestäm den erforderliga mängden av Streptavidin
OBS: Effekten av den blockerande signalen härledd från extracellulärt virus bestämmer detektionsområdet för analysen. Därför är det viktigt att upphäva STV-Cy3-signalen så mycket som möjligt. The erforderlig mängd STV behövs beror på mängden biotinylerat virus materiel som används (bestämd enligt punkt 2).
- Följ steg 2.1-2.4, men använd viruskoncentration bestämts enligt punkt 2.
- Bered fem-faldiga seriespädningar av STV spädda i PBS innehållande 2% BSA och 0,1% natriumazid.
- Spin rören vid 4 ° C under 3 min vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 50 pl STV utspädning. Som imiterad kontroll användning PBS innehållande 2% BSA och 0,1% natriumazid utan STV. Inkubera rören i 30 minuter på is. Sedan upprepar tvättsteg som beskrivs i 2.4.
- Följ steg 2,5-2,9. För interna analysen väljer den lägsta koncentrationen av STV vilket resulterar i en stark block av Cy3-signalen (jämfört med provet i vilket inget STV var närvarande). För detta kan man använda procentandelen av Cy3-positiva celler eller medelfluorescensintensiteten hos Cy3-signalen. Helst bör Cy3-signalen i STV-behandlade prover vara så nära signalen från falsk-infekteradesceller som möjligt.
4. Fastsättning / Interna Assay
OBS: Se till att förbereda alla reagenser innan analysen. För de tre kontrollgrupperna som presenteras i avsnittet resultat (skeninfekterade celler, neuraminidas förbehandlade celler och natriumazid behandlade celler) små förändringar i protokollet krävs.
- Förbered 16 Deepwell tuber à 200.000 A549-celler. Bredvid den experimentella bestående av 4 rör, det finns 3 kontrollbetingelser, var och en kräver 4 rör: skeninfekterade celler, neuraminidas (NA) -pretreated celler och natriumazid behandlade celler. Varje grupp består av 4 rör märkas "0 min", "0 min + STV", '30 min ", '30 min + STV.
- Spin rören vid 4 ° C under 3 min vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 pl PBS.
- Spin rören vid 4 ° C vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pellet i 200 pl DMEM innehållande 0,3% BSA, 20 mM HEPES och 1% penicillin-streptomycin (inkubationsmedium). Inkubera under 30 minuter vid 37 ° C.
OBS: För neuraminidas kontroll: Använd bakteriell neuraminidas (t.ex. sialidas från Vibrio cholera) vid en koncentration av 200 mU / ml utspädd i inkubationsmedium att resuspendera cellerna. - Spin rören vid 4 ° C under 3 min vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 pl PBS. Upprepa detta steg en gång, sedan kalla rören ned på is under 10 minuter.
- Spin rören vid 4 ° C under 3 min vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 pl biotinylerad virus (använd viruskoncentration bestämd enligt punkt 2 utspädd i infektions-PBS). Inkubera 1 timme på is. Sedan upprepar tvättsteg som beskrivs i 2.4.
OBS: För skeninfekterades kontroll: Använd infektion-PBS utan virus. För natriumazid kontroll: Använd-virus utspätt i infektion-PBS kompletterad med 0,1% natriumazid. - Probearbetning av proverna efter infektionen på is:
- För "0 min prover, följ steg 2,5 och lagra prover vid 4 ° C tills de andra proverna är fasta.
- För "0 min + STV 'prover, spinnrören vid 4 ° C under 3 min vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 50 pl STV (använd koncentration bestämd enligt punkt 3) utspädd i PBS innehållande 2% BSA och 0,1% natriumazid (för att förhindra interna vid hantering av provet). Inkubera 30 minuter på is. Följ steg 2,4-2,5 och lagra prover vid 4 ° C.
- För '30 min prover, spin rören vid 4 ° C under 3 minuter vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 | il PBS innehållande 2% BSA. Inkubera 30 minuter vid 37 ° C. Följ steg 2,4-2,5 och lagra prover vid 4 ° C.
OBS: För natriumazid kontroll: Använd PBS kompletterad med 2% BSA och 0,1% natriumazid för 30 min inkubation vid 37 ° C. - För "30 min + STV "prover snurra rören vid 4 ° C under 3 minuter vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 | il PBS innehållande 2% BSA. Inkubera 30 minuter vid 37 ° C. Därefter spinn rören vid 4 ° C under 3 min vid 450 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 50 pl STV (använd koncentration bestämd enligt punkt 3) utspädd i PBS innehållande 2% BSA och 0,1% natriumazid (för att förhindra interna vid hantering av provet). Inkubera 30 minuter på is. Följ steg 2,4-2,5 och lagra prover vid 4 ° C.
OBS: För natriumazid kontroll: Använd PBS kompletterad med 2% BSA och 0,1% natriumazid för 30 min inkubation vid 37 ° C.
- Följ steg 2,6-2,8 och analysera prover med flödescytometri. Bestämma procenten Cy3-positiva celler i varje prov.
- Beräkna procentandelen bifogade viruset och den relativa mängden av internaliserad viruset.
- För att beräkna mängden bifogade virus, använd andelen Cy3-positive grindade celler eller medelfluorescensintensiteten hos Cy3-signalen. För jämförelse ställer obehandlade celler till 100% (figur 4B).
OBS: Den procentuella andelen bifogade viruset beskrivs av "0 min" prov. - För att beräkna mängden interna virus, ta förhållandet mellan "30 min + STV" prov till "30 minuter" prov (figur 5B).
OBS: Som nämnts ovan, kan den procentuella andelen av Cy3 positiva gated celler eller medelfluorescensintensiteten hos den Cy3-signalen användas.
- För att beräkna mängden bifogade virus, använd andelen Cy3-positive grindade celler eller medelfluorescensintensiteten hos Cy3-signalen. För jämförelse ställer obehandlade celler till 100% (figur 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tecknad som beskriver de fyra olika experimentella förhållanden visas i figur 1 Resultat från ett representativt experiment presenteras i figurerna 2 -. 5. I "0 min" prov, är biotinylerat virus kall bunden till målceller som kan visualiseras genom STV-Cy3 färgning (figur 1 och 2). När en blockerande steg (i "0 min + STV" prov) tillämpas, kan viruset på cellytan inte längre kan detekteras av STV-Cy3 färgning. Som ett resultat är signalintensiteten i "0 min + STV" prov starkt reducerad jämfört med den "0 min" prov (figurerna 1 och 2). Vid höjning av temperaturen till 37 ° C, är fäst viruset upptas i cellerna ("30 min" prov). Internaliserad virus är inte känslig för blockering med omärkt STV vilket resulterar i en mindre dramatisk minskning i signalintensitet i & #8220; 30 min + STV "prov i förhållande till den" 30 min "prov i vilka ingen STV blockering applicerades (figurerna 1 och 2).
Som kontroller vi använde falsk infektion, NA behandling och SA behandling. Figur 3 visar den procentsats av Cy3-positiva celler för alla experimentella betingelser som beskrivs i avsnitt 4. Mock-infekterade celler ger bakgrundssignalstyrkan för experimentet och agera som negativ kontroll för virus fäste (Figur 4). En ytterligare kontroll för virus kvarstad är behandling med bakteriellt uttryckt NA. NA avlägsnar sialsyra, receptorn för IAV fastsättning, från glykoproteiner på cellytan och därigenom minskar bindning av viruset till målceller 17. Såsom visas i fig 4, behandling med NA starkt upphäver IAV fastsättning med cirka 90% jämfört med obehandlade celler. När det gäller internalisering, använde vi SA som kontroll. SA tr eatment tömmer snabbt cellulära ATP-nivåer och därmed hämmar energiförbrukande processer såsom endocytos 13. Inkubering av celler med SA under och efter infektion hämmade internalisering av viruspartiklar. Den relativa mängden av internaliserad virus (avbildad i figur 5) höjdes från cirka 10% till 45% genom inkubation vid 37 ° C under 30 min i obehandlade celler. Efter SA behandling emellertid andelen relativ internaliserad virus var omkring 15% för båda, cellerna inkuberades under 0 och 30 minuter vid 37 ° C. Detta tyder på att faktiskt minskar SA den effektivt upptag av viruspartiklar i celler.
Figur 1. Principen om analysen. Cartoon förklarar principen för in- / interna analys.= "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa resultat för IAV fastsättning och interna. (A) Histogram visar signal intensiteten för Cy3 signal för obehandlade celler. Visas är "0 min", "0 min + STV", "30 min" och "30 min + STV" prov. (B) Procent av Cy3-positiva celler från A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa resultat för fastsättning och internalisering inklusive kontroller. Rong> Andel Cy3-positiva A549-celler efter angivna behandling. Visas är mock-infekterade, obehandlade, NA-behandlade och SA-behandlade celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Hämning av virus fastsättning av neuraminidas. (A) Histogram som visar Cy3-signalintensiteten av "0 min" prover. Visas är obehandlade celler (i blått) och två kontrollprover: mock-infekterade och NA-behandlade celler (i rött och orange, respektive). (B) Procent av Cy3-positiva celler från A. Visade är håna, obehandlade och NA-behandlade celler från "0 min" prov. Värdet för obehandlade celler var inställd på 100%.com / filer / ftp_upload / 53372 / 53372fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Inhibering av virusinterna genom natriumazid (SA). (A) Histogram som visar Cy3-signalintensiteten av "30 min" och "30 min + STV" prover från obehandlade (i röd och orange, respektive) och SA- behandlade (i blått och grönt, respektive) celler. (B) Procent av relativ intern virus från obehandlade och SA-behandlade celler efter 0 och 30 minuter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår protokoll beskriver ett enkelt sätt att mäta virus kvarstad och internalisering av flödescytometri. Det medger användning av märkt vildtyp virus som härmar mer noggrant virusinfektioner jämfört med användningen av viruslika partiklar (VLP). Medan våra protokoll har optimerats för att mäta vidhäftning och internalisering av IAV det kan lätt anpassas för andra virus. Dessutom, som flödescytometri används för avläsning, co-färgningar kan enkelt läggas till protokollet t.ex. för att testa uttrycksnivåer efter knockdown eller överuttryck av ett protein av intresse. Således tillåter analys för modifieringar av det protokoll beroende på de individuella behoven. Notera, kan analysen också utföras för en serie tidpunkter för att mäta virusinterna över tiden och få kinetisk information. Detta kan vara särskilt viktigt om analysen skulle vara anpassad för ett annat virus med okända internalise kinetik.
However, bör det noteras att fönstret för upptäckt är relativt liten eftersom skillnader i bilaga eller interna inträffa på en linjär skala på grund av frånvaron av viral replikation. För att öka förtroendet och minska buller som vi rekommenderar inbegripet kontroller (t.ex. kontroller beskrivits ovan) och flera replikat. Medan resultaten som visas avbildar ett representativt experiment observerade vi god överensstämmelse mellan olika experiment: Till exempel för fastsättning, den procentuella andelen av Cy3-positiva celler varierade från 60 till 80%; för internaliserad virus vi fått värden på mellan 40-60%.
Innan analysen påbörjas är det viktigt att titrera de arbetande koncentrationerna av de använda reagens såsom STV STV-Cy3 och mängden biotinylerat viruset. Observera att mängden reagens och inkubationstider kan variera beroende på cellinjen och virusstam som används. För att maximera fönstret för upptäckt, procentandelen celler positiva för virus attachment bör vara så hög som möjligt i "0 min och" 30 min "prov (beroende på mängden av biotinylerad virus som används) och så lågt som möjligt i" 0 min + STV "prov (beroende på mängden av STV används ). Dessutom kan buller reduceras genom att hålla cellerna vid 4 ° C under centrifugering och genom tvättning med iskall PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från Swiss National Science Foundation (31003A_135278) SST. MOP är mottagare av utbildningsbidrag från AXA Research Fund. Vi tackar Patricia Nigg för hjälp med utformningen av figur 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
References
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
