We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.
We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.
Fosfolipider er viktige komponenter i cellemembraner og membraner i organeller, og fluiditeten av disse membranlagene ofte påvirker cellefunksjoner ved å endre aktiviteten av membranproteiner 1 – 3. For eksempel, membran lipid homeostase oppnås ved å regulere membranfluiditet, som blir detektert av membranproteiner, og et unormalt nivå av flyt forårsaker alvorlige sykdommer, slik som hepatisk steatose og kolestase 4. I tillegg er flytende av et fosfolipid monolaget ved luft-væske-grensesnittet alveolene har viktige implikasjoner i sine funksjoner. Høy fluiditet i lungene overflateaktive fosfolipid monolaget letter spredning av laget under inhalering, mens en lav fluiditet gjør det mulig å holde seg innenfor sjiktet alveolene under utånding 5,6. Det er derfor viktig å estimere fluiditeten av fosfolipid-lag for å forstå deres roller.
_content "> En direkte måling av fluiditet er viskositeten, og viskositeten av fosfolipid-lag er blitt målt ved hjelp av mikronstore kolloider 7, magnetiske nåler 8,9, og magnetiske mikro knapper 6,10,11. Imidlertid er disse teknikker er begrenset til relativt stive filmer, og kan ikke måle mindre viskøse filmer. For slike tilfeller ville diffusiviteten være et alternativ å kvantifisere flyt av fosfolipid lag. I flere tiår har en rekke teknikker for å måle diffusjonsegenskaper av fosfolipid lag blitt utviklet, slik som fluorescensslukking metode 12, pulset feltgradient NMR 13, og fluorescens korrelasjonsspektroskopi (FCS). 14 En av de mest representative metoder er fluorescensgjenvinning etter fotobleking (FRAP) 15,16. På grunn av enkelheten i måleprosedyren, og tilhørende teorier, flere studier på diffusjonsegenskaper av fosfolipid lag er utført ved hjelp av FRAP <sup> 17 – 19. Men FRAP krever vanligvis en dyr konfokalmikroskop oppsett med en høyeffekts laser.Her presenterer vi en ny teknikk for å måle lateral spredning av fosfolipid monolag, betegnes som fluorescens gjenoppretting etter sammenslåing (FRAM). Hovedforskjellen mellom FRAP og FRAM er at fotobleking trinnet erstattes med rulle koalesens. Flette en dråpe dekket av non-fluorescens enkeltlag på en fluoresceinmerket flat monolater en sirkel mørk flekk på en lys flat enkeltlag, og dermed sette opp samme opprinnelige tilstand med fotobleking trinn. Vi deretter observere fluorescensen bedring i mørk flekk med tiden for å måle lateral diffusivitet. Denne nye "bleking" trinn for dråpe koalescens gir betydelige fordeler i forhold FRAP: FRAM krever bare et fluorescensmikroskop snarere enn en kostbar konfokalmikroskop med høyenergi lasere som er nødvendig for FRAP. Jegn tillegg har FRAM et bredt utvalg av fluorescens-farvestoffer, siden det ikke involverer fotobleking prosessen. Til slutt, de to forskjellige monosjikt, et dråpemonosjikt og et flatt monolag, kan fremstilles uavhengig av hverandre, og dermed tillater interdiffusjon som skal måles, mens FRAP måler bare den selv-diffusjon av monolag.
FRAM tilbyr et bredt spekter av diffusjon målinger fra svært viskøse materialer til nesten ikke-viskøs materialer. I prinsippet kan FRAM måle den maksimale diffusiviteten av 10 6 mikrometer 2 / sek, noe som er sammenlignbart med eksisterende teknikker, da diffusjon finner sted over området 100 mikrometer ved 100 nm i løpet av tiden for slipp koalescering prosessen (~ 10 msek). Videre kan langsom diffusjonsprosess enkelt måles med mindre mono er solide. FRAM kan brukes for alle typer overflateaktive materialer så lenge som egnede fluorescens-merkede molekyler er tilgjengelige.
FRAM deler mye av grunnleggende prinsipper med FRAP, spesielt for måling av fluorescens gjenoppretting etter bleking et bestemt område, men FRAM bruker en prosess med sammenslåing en dråpe på flat-grensesnittet for å danne et bleket området, i stedet for å bruke et intensivt lys. Fusjonsprosessen er således det viktigste trinnet i FRAM, og spesielt, i form av den mørk flekk på det flate monolaget etter sammenslåing en dråpe bestemmer nøyaktigheten av målingen diffusivitet. Nærmere bestemt, basert på en aktuell metode, vi bare setter sirkel med en radius R som en region av interesse å beregne den gjennomsnittlige intensiteten av mørk flekk, som vist i fremgangsmåte 4, og hvis det finnes en for mye avvik fra den sirkulære form, dette ville forstyrre den nøyaktige måling av en diffusjonskoeffisient. Derfor er det nødvendig å oppnå en sirkelformet mørk region, men ikke er runde er dannet av og til på grunn av flere årsaker. Først, hvis det finnes en konvektive flyt i Petri fatet, i form av det mørke området blir forlenget langs strømningsretningen. Som nevnt i fremgangsmåte 1,3, hjelper en kjegleformet apparat for å undertrykke den konvektive strømning, og denne forlengelse vil bli minimalisert. For det andre, dersom den ytre enden av kapillæret berører den flate grensesnitt under et fusjonsprosessen, er det mørke området utformet med en rekke former, siden de kapillære enden avbryter fusjonsprosessen. Ved å skaffe en dråpe som bare henger fra enden av kapillæret, kan dette avbruddet forhindres. Spesielt en hydrofob behandling av kapillaren bidrar dråpene til å sitte ved enden av kapillæret. Derfor ovennevnte problemer skyteepisoder og modifikasjoner gjør oss i stand til å måle diffusjonsegenskaper mer presist.
Denne brønnen trouble prosessen gjør dermed FRAM å ha flere betydelige fordeler fremfor FRAP. Først FRAM krever enklere utstyr enn FRAP. For FRAM, er det tilstrekkelig å bruke en enkel fluorescens microsklare, i stedet for en kostbar konfokalmikroskop med en høyeffekts laser hvis bølgelengde må samsvare med absorpsjonsspekteret av fargestoffet. I tillegg er det nødvendig å bruke ytterligere apparatur for å justere størrelsen til det blekede område i FRAP, mens FRAM styrer størrelsen på området lett ved å justere størrelsen på dråpene, eller overflatetrykket på dråpeoverflaten. For det andre er det mulig å bruke ulike arter av fargestoffer i FRAM. FRAP bruker bare fargestoffmolekyler som blekeprosessen er mye raskere enn diffusjonsprosessen. Hvis det oppstår diffusjon av fargestoffer som under blekeprosessen, er det vanskelig å estimere egenskapen diffusjon nøyaktig. Den FRAM imidlertid ikke krever en prosess for bleking av farvestoffer, og dette gjør det således mulig å bruke ulike typer av fargestoffer på fluorescens-avbildning. I tillegg krever FRAP ekstra høyeffektslasere og filter sett å endre fargestoff arter, mens det kun er nødvendig å skifte ut filtersett i FRAM. EndeligSiden monolagene på dråpeoverflaten og den flate grensesnitt kan dannes uavhengig av hverandre, noe som muliggjør studium av inter-diffusjon eller blanding mellom to lipid monolag ved å slå sammen A-type monolag til B-type monolaget, mens den FRAP bare måler selv diffusjon av en monolayer.
Til tross for disse fordelene, kan prosessen med å slå sammen en dråpe på en flat luft-vann-grensesnittet potensielt begrense denne teknikken på grunn av flere forhold som kan være av interesse, for eksempel et overflatetrykk mismatch mellom de to monolagene, tidsskalaen for fusjonsprosessen og en økning i overflatetrykket av det flate monolaget etter sammenslåing dråper. Disse problemene er imidlertid ikke påvirke spredningen målingen betydelig av følgende grunner. Først, selv om overflatetrykk på de to forskjellige monolagene er ganske forskjellige, er en likevekts prosess gjennomført på et svært tidlig stadium under gjenopprettingsprosessen. For eksempel, hvis tHan overflaten trykket av monolaget på dråpeoverflaten er høyere enn for den monolaget på den flate grensesnittet luft-vann, utvider det mørke området inntil overflatetrykket likevekt. Siden denne prosessen er fullført innen 10 millisekunder, vil det overflatetrykket ekvilibreres før det påvirker diffusjonen prosessen betydelig. For det andre, dersom tidsskalaen for fusjonsprosessen er rask nok, vil det ikke begrenser diffusjonen målingen i det hele tatt. Heldigvis er en typisk fusjonsprosessen også fullført innen 10 msek. Til slutt, selv multiplum sammensmelting av dråpene på de plane grensesnitt ikke øke overflatetrykket, siden overflatearealet av rennen langt større enn overflatearealet av dråpe. I henhold til størrelser av trauet, og dråpene, som er beskrevet i protokollen, den areal per molekyl øker mindre enn 0,015% ved å slå sammen en dråpe. Følgelig er økningen av overflatetrykket på grunn av endringen av areal per molekyl mindre enn 0,1%, noe som er negligible fordi det er mye mindre enn den typiske feil i overflatetrykket, målt ved Wilhelmy plate tensiometer.
I sammendraget, vi innført en ny metode for å måle lateral diffusjon tilhører et fosfolipid enkeltlag ved å flette en dråpe enkeltlag på flat-grensesnittet. Denne teknikken krever relativt enkelt utstyr, og også muliggjør bruk av ulike typer fargestoff arter. Den FRAM er således potensielt anvendelig for diffusjon måling av eventuelle overflateaktive midler, inkludert fosfolipider, blokk-kopolymerer, proteiner og til og med nanopartikler i en væske-væske-grensesnittet. Videre forventer vi at FRAM gir en ny måte å studere inter-diffusjon og blanding mellom to forskjellige overflateaktive stoffer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av KAIST-finansierte K-dalen RED & B-prosjektet for 2014 og Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).
Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
Deionized water/Water purify system | Millipore | Milli-Q liocel | >18.2 MΩ·cm |
Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3 |
Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10x NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |