The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
La prostate est un tissu hétérogène composée d'épithélium sécrétoire disposé dans acini glandulaires entouré par stroma fibromusculaire composée principalement de muscle lisse 1. Le compartiment épithélial est composé de cinq différents types de cellules, mais organisés: cellules basales, les cellules sécrétoires, les cellules neuroendocrines, cellules amplificatrices de transit et les cellules souches 2. Dans cancer de la prostate (CaP), qui provient des cellules épithéliales luminales, la croissance de l'adénocarcinome provoque une baisse progressive évidente du compartiment stromal 3. Pour ces raisons, les échantillons de tissus auront des différences distinctes dans la proportion et le type de stroma des cellules épithéliales en fonction de l'étendue de la PCa. Ces différences peuvent conduire à des hypothèses biaisées des données d'expression génique acquis à partir de tissus entiers sans égard à la microdissection du type de cellule souhaité. Par conséquent, pour éliminer ce biais, il est essentiel de séparer les types de cellules avant l'extraction de l'ARN etanalyse de l'expression génique.
Macrodissection microdissection ou peuvent être utilisés pour séparer physiquement les régions epitheliales bien caractérisés du stroma entourant 4 -6. Macrodissection est généralement fait avec une lame de rasoir sous un microscope de dissection et fonctionne bien pour séparer grande CaP nodules de stroma, mais ne sont pas capables d'éliminer l'épithélium bénin du stroma entourant (voir l'exemple de bénigne de la prostate histologie à la figure 1). Microdissection avec un laser (LCM) est nettement plus de travail que macrodissection, mais peut disséquer de façon très précise l'épithélium bénigne 4.
Publications récentes de notre laboratoire ont montré que l'ARN peut être extrait avec succès par LCM soit de paraffine (FFPE) biopsies fixés au formol ou tissu congelé 4,7-9. Les principaux défis dans l'extraction LCM-ARN sont 1) de disséquer avec précision les zones souhaitées du tissu, et 2) de préserver RL'intégrité NA 4,10 au cours de la processus de LCM et l'isolement. ARN isolé à partir des populations de cellules pures peut être utilisé pour l'analyse de l'expression génique par plusieurs méthodes comprenant la transcription inverse-PCR quantitative (RT-qPCR) 7,8, microarray 11, et 12 à 14 -sequencing profond.
L'objectif de ce protocole est d'isoler l'ARN total de LCM prostate épithélium du tissu congelé pour analyse l'expression des gènes en aval.
Profil d'expression génique à partir de spécimens humains peut être difficile, non seulement pour la qualité ou la quantité de tissus disponibles, mais aussi pour les différentes entités histologiques présents dans un échantillon de tissu donné. Cela est particulièrement difficile dans la prostate dans laquelle tissus bénins sont en grande partie des tissus et des domaines du cancer stromales sont dépourvues de stroma. LCM facilite la séparation physique de la prostate stroma et épithélium de l'…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
PEN-membrane 4,0 mm slides | Leica | 11600289 | |
Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |