Summary

Вода в масле: Новая система для сборки растворимых в воде Хлорофилл-связывающих белков с гидрофобными Пигменты

Published: March 21, 2016
doi:

Summary

Эта рукопись описывает простую и высокую пропускную способность метода для сборки водорастворимых белков с гидрофобными пигментов, которая основана на воде в масле. Показана эффективность метода в сборке отечественных хлорофиллов с четырьмя вариантами рекомбинантного растворимого в воде-хлорофиллом связывающих белков (WSCPs) из Brassica растений , выраженных в Е. палочки.

Abstract

Хлорофилл (ЧЛС) и бактериохлорофиллы (BChls) являются основными кофакторами, которые осуществляют сбор урожая фотосинтетический света и переноса электронов. Их функциональные возможности в значительной степени зависит от их конкретной организации в крупных и сложных белковых комплексов мультисубъединичный трансмембранных. Для того, чтобы понять, на молекулярном уровне, как эти комплексы облегчить преобразование солнечной энергии, важно понимать белок-пигмент, и пигмент-пигментных взаимодействия, а также их влияние на динамику возбужденными. Одним из способов получения такого понимания является путем построения и изучения комплексов ЧЛС с помощью простых водорастворимых рекомбинантных белков. Тем не менее, включающий липофильные ЧЛС и BChls в водорастворимые белки трудно. Более того, не существует общего метода, который может быть использован для сборки водорастворимых белков с гидрофобными пигментов. Здесь мы покажем простую и высокую пропускную способность системы, основанной на воде в масле, что позволяет задницуembly водорастворимых белков с гидрофобными ЧЛС. Новый метод был проверен путем сборки рекомбинантных версий растворимого в воде хлорофилла связывающего белка Brassicaceae растений (WSCP) с Хл. Показано , успешное проведение монтажных работ Хл А с использованием сырой лизаты WSCP , выражающие E. палочка клетка, которая может быть использована для разработки генетической системы экрана для новых водорастворимых белков Chl-связывающих, а также для изучения Хл-белковых взаимодействий и процессов сборки.

Introduction

Гидрофобные пигменты, такие как хлорофиллы (ЧЛС), бактериохлорофиллов (BChls) и каротиноидов являются основными кофакторами в фотосинтезирующих реакционных центров и легких белков лесозаготовок, которые осуществляют перенос электронов, а также захватить световой энергии и передачи. Центры реакции и большинство Chl-связывающих уборочных комплексов легких являются трансмембранными белками. Fenna-Мэттьюз-Olson (Предприятию) белок не-кислородных бактерий фотосинтетический зеленовато-серой 1,2, а белок перидинина-Хл (РСР) динофлагеллят 3 являются исключительными примерами водорастворимых белков светособирающих. Водорастворимые хлорофилл связывающие белки (WSCPs) из Brassicaceae, Polygonaceae, маревых и Amaranthaceae растения 4, 5 являются еще одним уникальным примером, но в отличие от FMO и PCP, они не являются ни участвовать в легкой уборке , ни в какой – либо реакции первичного фотосинтетического , и их точное PHYsiological функции пока неясно , 5-8. Их высокое сродство Хл связывания привели к предложенной функции в качестве переходных носителей ЧЛС и производных Chl 9,10. В качестве альтернативы, была выдвинута гипотеза о том , что WSCP играет роль в продувочного ЧЛС в поврежденных клетках и защищает от Chl-индуцированной фотоокислительном повреждения 7,11-13. Совсем недавно было высказано предположение , что функции WSCP в качестве ингибитора протеазы и играет определенную роль в процессе сопротивления травоядных , а также регулирует гибель клеток во время развития цветка 14. WSCPs делятся на два основных класса в зависимости от их фотофизические свойства. Первый класс (класс I, например. От марь белая) могут подвергаться фотоконверсии при освещении. Класс WSCPs II из Brassica растений, которые не претерпевают фотоконверсии 5,10, далее подразделяются на класс IIa (например., Из капуста огородная, Raphanus Sativus) и IIb (например., От Lepidium virginicum </eм>). Структура класса IIb WSCP из Lepidium virginicum была решена с помощью рентгеновской кристаллографии с разрешением 2,0 Å 8. Она показывает симметричный гомотетрамера, в котором белковые субъединицы образуют гидрофобную сердцевину. Каждая субъединица связывает одну Chl, что приводит к жесткой расположение четырех плотно упакованными CHLS в пределах core.This просто вся компоновка Хл делает WSCPs потенциально полезную модель системы для изучения связывания и сборки Хл-белковых комплексов, а также влияние соседних CHLS и белковые среды на спектральные и электронных свойств отдельных ЧЛС. Кроме того, она может предоставить шаблоны для построения искусственных Chl-связывающих белков, которые могут быть использованы для светособирающих модулей в искусственных устройствах фотосинтетических.

Строгие исследования нативных WSCPs не представляется возможным , поскольку комплексы , очищенные из растений всегда содержат гетерогенную смесь тетрамеров с различными комбинациями Хли Хл б 9. Таким образом, способ сборки рекомбинантно экспрессировать WSCPs с ЧЛС в пробирке требуется. Это сталкивается с проблемой незначительной растворимостью в воде ЧЛС , что делает невозможным собрать комплекс в пробирке путем простого смешивания водорастворимых апопротеины с пигментами в водных растворах. В пробирке сборки путем смешивания апопротеинов с мембранах тилакоидов 15 была продемонстрирована, но этот способ ограничен нативной ЧЛС, присутствующего в тилакои. Шмидт и др. сообщила о сборке нескольких CHL и ВСЫ производные WSCP из цветной капусты (CaWSCP) путем рекомбинантно экспрессии гистидин-меченый белок в Е. палочки иммобилизации его на колонку Ni-аффинной и введение CHL производных растворили в моющих средствах 11. Успешно восстановление рекомбинантных WSCPs из A. thaliana 6, и брюссельская капуста (BoWSCP), японская дикая редька (RshWSCP)d Вирджиния pepperweed (LvWSCP) аналогичным методом были также зарегистрированы.

Здесь мы представляем новый, общий, простой метод для сборки ЧЛС с WSCP, которые не требуют мечение или иммобилизации белков. Он опирается на приготовления эмульсий из их водных растворов водорастворимых апобелков в минеральном масле. Белки , таким образом , инкапсулированные в воде в масле (W / O) микрокапель с очень высокой удельной поверхностью по отношению к объему 16. Гидрофобные кофакторы затем растворяют в масле и легко введены в капельки из масляной фазы. Мы сообщаем об использовании способа сборки нескольких вариантов WSCP апобелков рекомбинантно экспрессировали в E. палочка с Хл. Продемонстрирована сборку из сырого лизата WSCP-гиперэкспрессией бактерий, которые могут быть использованы в качестве системы скрининга для разработки новых CHL связывающих белков.

Protocol

1. Подготовка CHL запаса Решения ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Выполните все этапы подготовки хлорофилла в химической капот, под зеленым светом (520 нм) или в темноте, чтобы минимизировать фотоповреждения. Всегда добавляйте азот или аргон перед замораживанием пигментов для хранения. Убедитесь, ч?…

Representative Results

Рекомбинантные WSCP апопротеины были собраны с Хл в W эмульсий / O в соответствии с протоколом , описанным в предыдущем разделе. Протокол был реализован с использованием водной фаз , содержащих либо в чистом виде WSCPs или лизаты клеток E.coli с гиперэкспрессией WSCP (ри?…

Discussion

Наша цель состояла в том, чтобы разработать новую общую систему для сборки водорастворимых хлорофилл-связывающих белков с гидрофобными пигментов. Здесь показано , что новая система восстановление на основе W / O эмульсии общий подход доказал свою работу для сборки WSCP апобелков из брюсс?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DN признает поддержку со стороны 7РП ЕС проектов PEPDIODE (GA 256672) и REGPOT-2012-2013-1 (Г.А. 316157), и личный исследовательский грант (№ 268/10) от научного фонда Израиля. Мы благодарим профессора Шмуэля Рубинштейн, школа инженерных и прикладных наук, Гарвардский университет, Кембридж Массачусетс, США для принятия конфокальной микроскопии изображений.

Materials

Mineral oil Sigma M5904
Span80 Sigma 85548
Tween80 Sigma P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges Bio Rad 10011164 Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column GE Healthcare Life Science 17-5248-02 Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow GE Healthcare Life Science 17-0709-01 Chromatography medium for chlorophyll purification

References

  1. Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
  2. Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
  3. Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
  4. Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
  5. Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
  6. Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
  7. Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
  8. Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
  9. Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -. P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
  10. Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
  11. Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
  12. Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
  13. Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
  14. Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
  15. Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
  16. Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA – Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
  17. Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
  18. Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
  19. Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).

Play Video

Cite This Article
Bednarczyk, D., Noy, D. Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments. J. Vis. Exp. (109), e53410, doi:10.3791/53410 (2016).

View Video