Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine mit hydrophober Pigments
Summary
Diese Handschrift beschreibt eine einfache und Hochdurchsatzverfahren für wasserlösliche Proteine mit hydrophoben Pigmente Zusammenbauen, die auf Wasser-in-Öl-Emulsionen basiert. Wir zeigen die Wirksamkeit des Verfahrens bei der Montage von nativen Chlorophylle mit vier Varianten von rekombinantem wasserlösliches Chlorophyll-Bindungsproteine (WSCPs) von Brassica – Pflanzen in E. ausgedrückt coli.
Abstract
Chlorophylle (Chls) und bacteriochlorophylls (BChls) sind die primären Cofaktoren, die photosynthetischen Lichtnutzung und Elektronentransport durchzuführen. Ihre Funktionalität hängt entscheidend von ihrer spezifischen Organisation in großen und aufwendigen Multiuntertransmembranprotein-Komplexe. Um auf molekularer Ebene zu verstehen, wie diese Komplexe Umwandlung von Solarenergie zu erleichtern, ist es wesentlich, Protein-Pigment, und das Pigment-Pigment-Wechselwirkungen und ihre Wirkung auf die angeregten Dynamik zu verstehen. Eine Möglichkeit, ein solches Verständnis zu gewinnen, ist durch die Konstruktion und Komplexe von Chls mit einfachen wasserlöslichen rekombinanten Proteinen zu studieren. Jedoch ist die lipophile Chls und BChls in wasserlösliche Proteine enthält schwierig. Darüber hinaus gibt es kein allgemeines Verfahren, das für die Montage von wasserlöslichen Proteinen mit hydrophoben Pigmente verwendet werden könnten. Hier zeigen wir ein einfaches und hohen Systemdurchsatz auf Basis von Wasser-in-Öl-Emulsionen, die Esel ermöglichtembly von wasserlöslichen Proteinen mit hydrophoben Chls. Das neue Verfahren wurde durch Zusammenfügen von rekombinanten Versionen des wasserlöslichen Chlorophylls Bindungsprotein von Brassicaceae Pflanzen (WSCP) mit Chl validierten einem. Wir zeigen die erfolgreiche Montage von Chl a mit rohen Lysaten von WSCP E. exprimieren coli – Zelle, die für die Entwicklung eines genetischen Siebsystem für neue wasserlösliche Chl-Bindungsproteine verwendet werden können, und für Studien der Chl-Protein – Wechselwirkungen und Montageprozessen.
Introduction
Hydrophobe Pigmente wie Chlorophylle (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) und Carotinoide sind die primären Cofaktoren in photosynthetischen Reaktionszentren und Lichtsammelproteine, die den Elektronentransport durchzuführen, und Lichtenergie Erfassung und Übertragung. Die Reaktionszentren und die meisten der Chl-bindenden Lichtsammelkomplexe sind Transmembranproteine. Die Fenna-Matthews-Olson (FMO) Protein von nicht-oxygenic photo grün-Schwefelbakterien 1,2 und die Peridinin-Chl Protein (PCP) von Dinoflagellaten 3 sind außergewöhnliche Beispiele von wasserlöslichen Lichtsammelproteine. Die wasserlöslichen Chlorophyll – bindenden Proteinen (WSCPs) von Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae und Amaranthaceae Pflanzen 4, 5 sind ein weiteres einzigartiges Beispiel, aber im Gegensatz zu FMO und PCP, sind diese weder in einem Licht Ernte noch in einem der primären photosynthetischen Reaktions und ihre genaue PHYphysiologischen Funktionen sind noch unklar 5-8. Ihre hohe Chl-Bindungsaffinität haben zu einem empfohlenen Funktion führte als vorübergehende Träger von Chls und Chl Derivate 9,10. Alternativ wurde die Hypothese aufgestellt , dass WSCP spielt eine Rolle bei Spülung Chls in geschädigten Zellen und schützt vor Chl-induzierten Photooxidationsschäden 7,11-13. In jüngerer Zeit wurde gezeigt , dass WSCP Funktionen als Protease – Inhibitor vorgeschlagen und spielt während der Blütenentwicklung 14 eine Rolle bei der Pflanzenfresser Widerstand als auch reguliert Zelltod. WSCPs werden in zwei Hauptklassen aufgeteilt, den photophysikalischen Eigenschaften auf. Die erste Klasse (Klasse I, z. B. von Chenopodium album) kann Photokonversion bei Beleuchtung unterziehen. Klasse II WSCPs von Brassica – Pflanzen , die durchlaufen nicht fotovoltaischen 5,10, sind weiter in der Klasse IIa unterteilt (z. B. von Brassica oleracea, Raphanus sativus) und IIb (z. B. von Lepidium virginicum </em>). Die Struktur der Klasse IIb WSCP von Lepidium virginicum 8 wurde durch Röntgenkristallographie bei 2,0 Å Auflösung gelöst. Es zeigt eine symmetrische Homotetramers, in dem die Protein-Untereinheiten einen hydrophoben Kern bilden. Jede Untereinheit bindet ein einzelnes Chl, die in einer engen Anordnung Ergebnisse von vier dicht gepackten Chls innerhalb der core.This einfach alle Chl Anordnung WSCPs ein potentiell nützliches Modellsystem zur Untersuchung der Bindung und Montage von Chl-Protein-Komplexe bildet, und die Auswirkungen der benachbarten Chls und Protein-Umgebungen auf die spektralen und elektronischen Eigenschaften einzelner Chls. Darüber hinaus kann es Vorlagen bieten für die Konstruktion künstlicher Chl-bindende Proteine, die für die lichtsammelnden Module in künstlichen Photosynthese-Geräten verwendet werden kann.
Rigorose Studien von nativen WSCPs sind nicht durchführbar , da die Komplexe aus Pflanzen gereinigt immer ein heterogenes Gemisch von Tetrameren mit verschiedenen Kombinationen von Chl a enthaltenund Chl b 9. Somit wird ein Verfahren zur rekombinant exprimierten WSCPs mit Chls in vitro Zusammenbauen erforderlich. Dies wird durch die vernachlässigbare Wasserlöslichkeit Chls herausgefordert , die es unmöglich macht , den Komplex in vitro zusammenzubauen , indem einfach die wasserlöslichen Apoproteine mit Pigmenten in wässrigen Lösungen vermischt wird . In vitro Montage durch die Apoproteine mit Thylakoidmembranen Vermischen von 15 gezeigt wurde, aber dieses Verfahren ist mit dem nativen Chls in den thylakoids begrenzt. Schmidt et al. berichtete über mehrere Chl und BChl – Derivate mit WSCP von Blumenkohl (CaWSCP) Montage von rekombinant ein Histidin-markierten Protein in E. exprimieren coli Immobilisierung es auf eine Ni-Affinitätssäule und in Detergenzien 11 Chl Derivate solubilisiert einzuführen. Erfolgreich Rekonstitution von rekombinantem WSCPs von A. thaliana 6 und Rosenkohl (BoWSCP), Japanisch Hederich (RshWSCP) eind Virginia pepperweed (LvWSCP) durch ein ähnliches Verfahren wurden ebenfalls berichtet.
Hier stellen wir eine neue, allgemeine, einfache Methode zur Chls mit WSCP Montage, die nicht Tagging erfordert oder die Immobilisierung von Proteinen. Es stützt sich auf Emulsionen aus ihren wäßrigen Lösungen der wasserlöslichen Apoproteine in Mineralöl vor. Die Proteine werden daher in Wasser-in-Öl (W / O) Mikrotröpfchen mit sehr hohen Oberflächen – Volumen – Verhältnis 16 eingekapselt. Die hydrophoben Cofaktoren werden dann in dem Öl gelöst und leicht in den Tröpfchen aus Ölphase eingeführt. Wir berichten über die Verwendung der Methode für Apoproteine von mehreren Varianten von WSCP Montage rekombinant in E. ausgedrückt coli mit Chl a. Wir veranschaulichen die Anordnung aus rohem Lysat von WSCP-überexprimierenden Bakterien, die für die Entwicklung neuer Bindeproteine Chl als Screeningsystem verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unser Ziel war es, ein neues allgemeines System für die Montage von wasserlöslichen Chlorophylls-bindende Proteine mit hydrophoben Pigmente zu entwickeln. Hier wird gezeigt , dass das neue Rekonstitution System auf Basis von W / O – Emulsion ein allgemeiner Ansatz ist erwiesen , für die Montage von WSCP Apoproteine von Rosenkohl, Blumenkohl, japanischer Meerrettich und Virginia pepperweed rekombinant in E. ausgedrückt arbeiten coli. Hier werden Ergebnisse aus der Rekonstitution von 1 mg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DN dankt für die Unterstützung von EU – FP7 – Projekten PEPDIODE (GA 256672) und REGPOT-2012-2013-1 (GA 316157) und einer persönlichen Forschungsstipendium (Nr 268/10) von der Israel Science Foundation. Wir danken Prof. Shmuel Rubinstein, School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, Cambridge MA, USA für die konfokale Mikroskopie die Aufnahme von Bildern.
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
References
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -. P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA – Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
