المناهج التجريبية لدراسة الميتوكوندريا التعريب وظيفة من دورة الخلية النووية كيناز، Cdk1
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
في الثدييات، تقدم دورة الخلية يعتمد على الأحداث أمر غاية التي تسيطر عليها الحلقيات وتحركات تعتمد على السيكلين (Cdks) 1. من خلال حشوية لها، والطاقة النووية، وتوطين centrosomal، CyclinB1 / Cdk1 قادر على مزامنة الأحداث المختلفة في الانقسام مثل انهيار الغلاف النووي والانفصال الجسيم المركزي 2. CyclinB1 / Cdk1 يحمي الخلايا الإنقسامية ضد الخلايا 3 ويعزز الانشطار الميتوكوندريا، خطوة حاسمة لتوزيع متساو للالميتوكوندريا في الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا 4.
في تكاثر خلايا الثدييات، يتم إنشاء الميتوكوندريا ATP عن طريق الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) الأجهزة (الإلكترون سلسلة النقل)، الذي يتكون من 5 مجمعات متعددة فرعية. أنا معقدة – V معقدة (CI-CV). ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد الأدينين (NADH): مؤكسدة مختزلة يوبيكوينون أو معقدة الأول (CI) هو الأكبر والأقل يفهم من المجمعات الخمسة 5. ج معقدةonsists من 45 وحدات فرعية، منها 14 تشكل جوهر الحفاز. تجميعها مرة واحدة، يفترض مجمع هيكل على شكل حرف L مع ذراع واحدة بارزة في مصفوفة والذراع الأخرى جزءا لا يتجزأ من 6،7 الغشاء الداخلي. الطفرات في مفارز CI هي السبب في مجموعة متنوعة من اضطرابات الميتوكوندريا 8. مطلوب CI فعال وظيفيا في OXPHOS ليس فقط للتنفس الميتوكوندريا العام 9، ولكن أيضا لخلية الناجحة دورة التقدم 10. يمكن التكشف الآليات الكامنة وراء عمل هذا المجمع انزيم بغشاء في الصحة والمرض تمكن من وضع إجراءات تشخيصية جديدة والاستراتيجيات العلاجية المتقدمة. في دراسة أجريت مؤخرا، وجدنا أن CyclinB1 / Cdk1 مجمع translocates في الميتوكوندريا في (الفجوة 2) G2 / (الانقسام) المرحلة M وphosphorylates مفارز CI إلى تعزيز إنتاج الطاقة في الميتوكوندريا، يحتمل أن تكون لتعويض زيادة احتياجاتها من الطاقة من الخلايا خلال خلية دورة 11. نحن هنا SHOwcase الإجراءات التجريبية والاستراتيجيات التي يمكن استخدامها لدراسة النبات الميتوكوندريا من تحركات خلاف النووية / هيولي، ركائز من الميتوكوندريا وكذلك العواقب الوظيفية للتوطين الميتوكوندريا الخاصة بهم باستخدام CyclinB1 / Cdk1 كمثال على ذلك.
ورأت أن CyclinB1 / Cdk1 مجمع translocates في الميتوكوندريا عند الحاجة دفعت دراسات overexpression-الميتوكوندريا محددة وضربة قاضية لهذا المجمع. لتحقيق التعبير عن الميتوكوندريا محدد من البروتينات، يمكن للمرء أن إضافة تسلسل الميتوكوندريا التي تستهدف (MTS) في N-محطة من البروتين من الفائدة. الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل تسمح للفرز بروتينات الميتوكوندريا في الميتوكوندريا التي يقيمون فيها عادة 12. لقد استخدمت 87 الميتوكوندريا قاعدة تستهدف تسلسل المستمدة من السلائف السيتوكروم البشري ج أوكسيديز فرعية 8A (COX8) والمستنسخة ذلك إلى البروتين الفلوري الأخضر (GFP) -tagged CyclinB1 أو الأحمر نيونبروتين (RFP) -tagged Cdk1 تحتوي على البلازميدات في الإطار. يسمح هذا الأسلوب لنا لاستهداف CyclinB1 وCdk1 في الميتوكوندريا، وتغيير وجه التحديد التعبير الميتوكوندريا من هذه البروتينات دون أن يؤثر ذلك تجمع النووي. عن طريق وضع علامات fluorescently هذه البروتينات، كنا قادرين على مراقبة التعريب في الوقت الحقيقي. وبالمثل، أدخلنا MTS إلى البلازميد التي تحتوي على الموسومة طلب تقديم العروض المهيمنة سلبية Cdk1، الذي سمح لنا أن يطرق على وجه التحديد أسفل التعبير وظائف الميتوكوندريا من Cdk1. لا بد من التمييز بين وظائف الميتوكوندريا والنووية للتحركات التي لديها تعريب المزدوجة مثل Cdk1. هندسة MTS إلى N-محطة من هذه تحركات الوظيفية المزدوجة يقدم استراتيجية كبيرة أن من السهل استخدامها وفعالة.
منذ Cdk1 هو كيناز دورة الخلية، وهو أساسي لتحديد تقدم دورة الخلية عندما يكون موضعيا Cdk1 إلى الميتوكوندريا. ولتحقيق ذلك، فإننا قد تستخدم لmetho جديدد لمراقبة محتوى الحمض النووي في الخلايا. وتشمل الأساليب التقليدية باستخدام BrdU (bromodeoxyuridine)، والثيميدين التماثلية الاصطناعية، والتي تضم في الحمض النووي مركبة جديدة خلال مرحلة من مراحل دورة الخلية إلى استبدال الثيميدين. ثم الخلايا التي يتم تكرار بنشاط عينات من الحمض النووي يمكن أن يتم الكشف باستخدام الأجسام المضادة ضد BrdU. ومن عيوب هذا الأسلوب هو أنه يتطلب تمسخ من الحمض النووي لتوفير وصول الأجسام المضادة BrdU بواسطة أساليب قاسية مثل العلاج حامض أو الحرارة، مما قد يؤدي إلى عدم تناسق بين النتائج 13،14. بدلا من ذلك، نحن تستخدم نهجا مماثلا لمراقبة تقسيم الخلايا بنشاط مع التناظرية ثيميدين مختلفة، EDU. لا يتطلب الكشف ايدو قاسية تمسخ الحمض النووي كما تمكن العلاج المنظفات معتدل الكاشف الكشف للوصول إلى ايدو في الحمض النووي توليفها حديثا. وقد ثبت أن طريقة ايدو لتكون أكثر موثوقية، بما يتفق ومع إمكانية تحليل الإنتاجية العالية (15).
وأخيرا، رس تحديد ركائز الميتوكوندريا من Cdk1، استخدمنا أداة البروتينات تسمى 2D-DIGE، وهو نسخة مطورة من الكلاسيكية الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد. اثنين الكهربائي الأبعاد يفصل البروتينات وفقا لنقطة تساوي الكهربائية في البعد الأول والوزن الجزيئي في الثانية. منذ مرحلة ما بعد التعديلات متعدية مثل الفسفرة تؤثر على نقطة تساوي الكهربائية والوزن الجزيئي للبروتينات، يمكن أن المواد الهلامية 2D كشف عن الاختلافات بين الحالات الفسفرة من البروتينات داخل عينات مختلفة. حجم (المساحة وكثافة) من البروتين البقع التغييرات مع مستوى التعبير من البروتينات، مما يتيح المقارنة الكمية بين عينات متعددة. باستخدام هذا الأسلوب، كنا قادرين على التفريق بين البروتينات فسفرته في النوع البري مقابل Cdk1 الخلايا معربا عن متحولة استهداف الميتوكوندريا. تم عزل البقع البروتين المحددة التي أظهرت في النوع البري ولكن في عداد المفقودين في متحولة إعداد Cdk1 استهداف الميتوكوندريا وحددت عن طريق قياس الطيف الكتلي.
في المواد الهلامية 2D التقليدية، وتستخدم الأصباغ ثلاثي فينيل ميثان لتصور البروتينات على هلام. يستخدم 2D-DIGE تسميات بروتين فلوري مع تأثير ضئيل على البروتين التنقل الكهربي. عينات البروتين مختلفة يمكن أن توصف مع الأصباغ الفلورية مختلفة، مختلطة مع بعضها البعض وتفصل بينها المواد الهلامية متطابقة، والسماح للزملاء الكهربائي من عينات متعددة على هلام واحد 16. هذا يقلل من الاختلافات جل إلى جيل، وهي مشكلة خطيرة في دراسات البروتينات القائم على هلام.
Protocol
Representative Results
Discussion
مثل البروتينات الموجهة للعضيات التحت خلوية أخرى، فإن البروتينات الميتوكوندريا المستهدفة تمتلك إشارات تستهدف ضمن الهيكل الأساسي أو الثانوي في أن توجيهها إلى عضية بمساعدة translocating بروتين معقد وآلات للطي 21،22. الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل (MTS) تم الحصول عليها م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
References
- Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
- Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
- Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
- Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
- Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
- Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
- Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
- Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
- Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
- Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
- Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
- Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
- Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3′-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
- Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic ‘click’ reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
- Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
- Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25 (2009).
- Davies, D., Macey, M. G. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. , 257-276 (2007).
- van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
- Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
- Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
- Karniely, S., Pines, O. Single translation–dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
- Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
- Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341 (2010).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
- Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
- Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).
