Muse Dermal Fibroblast Isolering av FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
Fibroblaster er prinsippet celletypen ansvarlig for sekresjon ekstracellulær matriks, og er en viktig komponent i mange organer og vev. Fibroblast fysiologi og patologi ligge under et spektrum av kliniske enheter, blant annet fibroser i flere organer, hypertrofisk arrdannelse etter brannskader, tap av hjertefunksjon etter iskemi, og dannelsen av kreft stroma. Men fibroblaster forbli en dårlig karakterisert type celle, hovedsakelig på grunn av deres iboende heterogenitet. Eksisterende fremgangsmåter for isolering av fibroblaster krever tid i cellekulturer som dypt påvirker celle-fenotype og oppførsel. Følgelig mange studier som undersøker fibroblast biologi stole på in vitro manipulasjon og ikke nøyaktig fange fibroblast oppførsel in vivo. For å overvinne dette problemet, har vi utviklet en FACS-basert protokoll for isolering av fibroblaster fra dorsal hud av voksen mus som ikke krever cellekultur, for derved å preserving den fysiologiske transkripsjons- og proteomikk profil av hver celle. Vår strategi åpner for eksklusjon av ikke-mesenchymale linjene via en avstamning negativ gate (Lin -) i stedet for en positiv utvelgelse strategi for å unngå forhåndsvalg eller berikelse av en undergruppe av fibroblaster uttrykke spesifikke markører overflate og være så inkluderende som mulig over denne heterogene celletype.
Introduction
Fibroblaster blir ofte definert morfologisk som spindelformede celler som holder seg til plastunderlag. Fibroblaster er prinsippet celletype ansvarlig for å syntetisere og ombygging ekstracellulære matrise i embryonale og voksen organer 1. Fibroblaster er således avgjørende for pattedyr utvikling og bidrar i vesentlig grad til den ekstracellulære miljø som påvirker oppførselen til nabocelletyper som finnes i hvert vev og organ.
Fibroblaster er også rektor celletype bak et mangfoldig sett av medisinske tilstander som forårsaker enorm klinisk byrde. Patologisk fibroblast aktivitet hemmer normal vev funksjon og inneholder vev og organfibrose (for eksempel lunge og lever), arrdannelse etter kutan sårheling, aterosklerose, systemisk sklerose, og dannelse av ateromatøse plakker etter at blodkaret skade 2-5. Sårtilheling spesielt, både akutt og kronisk, innebærer deposition av arrvev som verken ligner heller ikke fungerer som normalt vev rundt det, og fører til betydelig sykelighet tvers av ulike patologiske tilstander. Etter skade, er det en overgang av fibroblaster til myofibroblasts, som deretter utskiller ECM strukturelle komponenter, utøve parakrine effekter på nabocelletyper, og gjenopprette mekanisk stabilitet ved å avsette arrvevet 6.
I kutane vev det finnes betydelig variasjon i kvaliteten på sårheling tvers utviklings tid og mellom anatomiske områder. I de to første trimester av livet fosteret helbreder uten arrdannelse; men fra den tredje trimester av og gjennom hele voksenlivet, mennesker leges med et arr. Sete-spesifikke, i tillegg til alder-spesifikke forskjeller i sårheling eksisterer. Sår i munnhulen oppussing med minimal arrdannelse 7,8, mens arrvev deponering innenfor kutane sår er betydelig 9. Kontrovers vedvarer concerning den relative påvirkning av miljøet versus de iboende egenskapene til de lokale fibroblaster på utfallet av sårheling i forhold til både alder og plassering 10,11. Gitt de betydelige forskjellene i helbredelsen av musen oral vs. kutane dermis og tidligere embryonale (E15) vs. senere embryonale (E18) dermis, er det sannsynlig at iboende forskjeller i bestandene av fibroblaster på visse utviklings aldre og blant ulike anatomiske områder eksisterer .
I 1986, Harold F. Dvorak hevdet svulster er sår som ikke leges 12. Dvorak konkluderte med at tumorer oppføre seg som sår i kroppen og indusere deres stroma ved å aktivere sårhelingsprosessen responsen av verten. Tallrike studier har undersøkt ettersom bidraget av fibroblaster til progresjon av karsinomer 13-15, men som i tilfelle av sårheling, identiteten og embryonal opprinnelse fibroblaster som bidrar til stromal rommet kutan ca.rcinomas er ikke tilstrekkelig definert. Svaret på dette spørsmålet bærer medisinsk relevans gitt nyere studier som avslører tumor-assosiert fibroblast som et potensielt effektiv mål for anti-kreft terapi 16.
Identifisere og prospektivt isolere fibroblast linjene begavet med fibrogenic potensial in vivo er et viktig skritt mot å effektivt manipulere sitt svar til skade over et bredt spekter av akutte og kroniske sykdomstilstander. I 1987 Cormack demonstrerte to subpopulasjoner av fibroblaster, en bosatt i papillær og ett innenfor retikulære dermis 17,18. En tredje undergruppe ble funnet i forbindelse med hårsekker i dermal papilla regionen av hårsekken 19,20. Når kultivert, disse fibroblast subtyper utstillingen forskjeller i vekstpotensial, morfologi, og vekstfaktor / cytokiner profiler 21-24.
Til dags dato, studier som undersøker fibroblast hanterogeneity har i stor grad klart å tilstrekkelig karakterutviklingsmessige og funksjonelle mangfold blant fibroblaster in vivo. Dette er, delvis, er et resultat av en avhengighet av dyrkede fibroblastceller populasjoner og homogenisere virkningen av cellekultur eller positiv seleksjon på basis av en selv overflatereseptor ikke uttrykkes av alle 25 fibroblaster. En fersk studie fra vår lab demonstrerte en dyp overflate markør og transkripsjonell skift i dyrkede vs. ukultur fibroblaster isolert av FACS-basert isolasjon metodikken presentert i dette manuskriptet 26.
Senere har vi identifisert en bestemt fibroblast avstamning innenfor den murine dorsal dermis og fastslått at denne i rett linje, definert ved embryonale ekspresjon av Engrailed-1, er primært ansvarlig for bindevev deponering i rygghuden. Avstamning funksjoner under både akutte og kroniske former for fibrose inkludert sårtilheling, kreft stroma dannelse, ogstråleindusert fibrose 27. Karakterisering av forskjellige fibroblast linjene har kritiske implikasjoner for terapi som tar sikte på å modulere fibrogenic atferd.
Snarere enn å bruke eksisterende protokoller som er avhengig av in vitro manipulasjon for å oppnå celleisolasjon 28,29, blir avlingen protokollen (figur 1) beskrevet her bidra til flyte omfattende analyser av fibroblaster som mer nøyaktig fange fenotype og oppførsel in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet gir et middel til å isolere fibroblaster ved hjelp av FACS-sortering basert, i forhold til eksisterende metoder, enten som selekterer for en subpopulasjon eller krever tid i cellekultur før senere analyser. Den tiden det tar fra høsting av huden til sortering av fibroblaster er ca 6 timer; vil imidlertid antall mus som brukes i innhøstningen påvirke dette estimatet.
Flere poeng i protokollen krever spesiell forsiktighet. Den første er ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet delvis av en bevilgning fra NIH stipend R01 GM087609 (HPL), en gave fra Ingrid Lai og Bill Shu til ære for Anthony Shu (HPL), NIH stipend U01 HL099776 (til MTL), den Hagey Laboratorium for Pediatric Regenerative Medicine og The Oak Foundation (til MTL, GCG og HPL). GGW ble støttet av Stanford School of Medicine, Stanford Medical Scientist Training Program, og NIGMS trening stipend GM07365. ZNM ble støttet av Plastic Surgery Foundation Stipendiat Grant og Hagey Family Fund. MSH ble støttet av California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Klinisk Fellow trening stipend TG2-01159, American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS) / Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award, og Transplant og Tissue Engineering Fellowship Award.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
References
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
- Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
- Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
- Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
- Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
- Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
- Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
- Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
- Cormack, D. H. . Ham’s Histology. , 450-474 (1987).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
- Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
- Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
- Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
- Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough – Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).
