El comportamiento de los fibroblastos subyace en un espectro de entidades clínicas, pero siguen estando mal caracterizadas, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. La investigación tradicional de fibroblastos se basa en la manipulación in vitro, enmascarando el comportamiento de los fibroblastos in vivo. Describimos un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de piel de ratón que no requiere cultivo celular.
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Artículo de método
Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los fibroblastos son el tipo de célula principio responsable de la secreción de la matriz extracelular y son un componente crítico de muchos órganos y tejidos. Fisiología y patología de fibroblastos subyacen a un espectro de entidades clínicas, incluyendo fibrosis en múltiples órganos, cicatrización hipertrófica siguientes quemaduras, pérdida de la función cardíaca después de la isquemia, y la formación de estroma cáncer. Sin embargo, los fibroblastos siguen siendo un tipo mal caracterizado de la célula, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. Los métodos existentes para el aislamiento de los fibroblastos requieren tiempo en el cultivo celular que influye profundamente en el fenotipo celular y el comportamiento. En consecuencia, muchos estudios de investigación de la biología de los fibroblastos se basan en la manipulación in vitro y no reflejan con precisión el comportamiento de fibroblastos in vivo. Para superar este problema, hemos desarrollado un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de la piel dorsal de ratones adultos que no requiere el cultivo de células, con lo que preserving de la transcripción fisiológica y el perfil proteómico de cada celda. Nuestra estrategia permite la exclusión de linajes no mesenquimales través de una puerta negativa linaje (Lin -) en lugar de una estrategia de selección positiva para evitar la preselección o el enriquecimiento de una subpoblación de fibroblastos que expresan marcadores de superficie específicos y ser lo más inclusivo posible a través de esta heterogénea tipo de célula.
Introducción
Los fibroblastos se definen con frecuencia morfológicamente como células en forma de huso que se adhieren a sustratos de plástico. Los fibroblastos son el tipo de célula principio responsable de sintetizar y remodelación de la matriz extracelular en embrionarias y adultas órganos 1. Los fibroblastos son por lo tanto fundamental para el desarrollo de mamíferos y contribuyen sustancialmente al medio extracelular que influye en el comportamiento de la vecina tipos presentes en cada tejido y órgano de células.
Los fibroblastos son también el tipo célula principal detrás de un conjunto diverso de condiciones médicas que causan enorm....
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Protocolo
Este protocolo sigue los métodos aprobados por el grupo administrativo de la Universidad de Stanford en el Laboratorio Animal Care.
1. La digestión de murinos Dermis
- La eutanasia a los ratones por dislocación cervical después de la anestesia con una inyección intraperitoneal de acepromacina 3 mg / kg de ketamina 100 mg / kg + xilazina 20 mg / kg +.
Nota: Varias edades y orígenes pueden ser utilizados. - Afeitarse y depilarse la piel dorsal. Aproximadamente 100.000 células se pueden aislar a partir de un trozo de piel dorsal 60 mm x 100 mm.
- Sumerja el ratón en etanol al 70% y colóquelo sobre una superfic....
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Resultados
La validez de este enfoque (Figura 1) se ha verificado en varias formas, que pueden ser examinadas en detalle en nuestra publicación reciente 27. Estos incluyen inmunocitoquímica de células clasificadas y masa celular y celular solo análisis transcripcional de células recién ordenados. Clasificación fibroblastos directamente en lugar de depender de la cultura con mayor precisión capta su fenotipo in vivo. Utilizando un enfoque de linaje negativo agotamiento (Figura 2) en lugar de un enfo.......
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Discusión
El protocolo se describe en este manuscrito ofrece un medio para aislar los fibroblastos de la clasificación basada en la FACS, en comparación con los métodos existentes, que seleccionar para una subpoblación o requieren tiempo en cultivo celular antes de los análisis posteriores. El tiempo requerido desde la cosecha de la piel a la clasificación de los fibroblastos es de aproximadamente 6 horas; sin embargo, el número de ratones utilizados en la cosecha influirá en esta estimación.
Varios p.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención del NIH subvención R01 GM087609 (a HPL), un regalo de Ingrid Lai y Bill Shu en honor a Anthony Shu (a HPL), NIH U01 subvención HL099776 (a MTL), el Laboratorio Hagey para Pediátrica Medicina Regenerativa y La Fundación Oak (al MTL, GCG y HPL). GGW recibió el apoyo de la Escuela de Medicina de Stanford, el Programa de Capacitación de Stanford Medical Scientist, y GM07365 beca de formación NIGMS. ZNM fue apoyado por la Cirugía Plástica Fundación de Becas de Investigación Grant y el Fondo de la Familia Hagey. MSH fue apoyado por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) Becario Clínico beca de formación TG2-01159, la Soci....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pinzas quirúrgicas | Kent Scientific | INS650916 | |
| Microtijeras | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Solución de preparación de yodo | Dynarex | 1415 | |
| Nair (crema depilatoria) | Church and Dwight Co. | ||
| Colagenasa IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastasa | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 16000-044 | |
| Tampón de lisado de cloruro-potasio (ACK) | Gibco | A10492-01 | |
| 40 μ m filtros | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 μ m filtros | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 μ m filtros | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| yoduro de propidio (tinción de viabilidad PI) | BioLegend | 421301 |
Referencias
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology.
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Reimpresiones y permisos
