Une méthode simple pour l'extraction des échantillons d'eau automatisée en phase solide pour immunologique analyse des petits polluants
Summary
A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.
Abstract
Une nouvelle méthode pour l'extraction en phase solide (SPE) des échantillons d'eau de l'environnement est proposé. Le prototype développé est rentable et conviviale, et permet d'effectuer des SPE rapide, automatisée et simple. La solution de pré-concentré est compatible avec l'analyse par immuno-essai, avec une faible teneur en solvant organique. Un procédé est décrit pour l'extraction et la pré-concentration de l'hormone naturelle 17β-oestradiol dans les échantillons d'eau de 100. SPE en phase inverse est effectuée avec sorbant octadécyl-silice et l'élution est effectuée avec 200 ul de methanol à 50% v / v. Eluant est dilué par addition de di-eau pour réduire la quantité de methanol. Après avoir préparé manuellement la colonne SPE, la procédure globale est effectuée automatiquement dans 1 h. A la fin du procédé, la concentration en estradiol est mesurée en utilisant un dosage immuno-sorbant lié à une enzyme du commerce (ELISA). Pré-concentration 100 fois et on obtient la teneur en méthanol dans seulement 10% v / v. Recouvrements complets de la moléculesont atteints avec 1 ng / L échantillons enrichis déminéralisée et synthétiques eau de mer.
Introduction
La préparation des échantillons est une étape importante dans tout processus analytique. En particulier, l'élimination des effets de matrice, la diminution des interférences, et l'enrichissement de l'analyte sont nécessaires pour obtenir des résultats précis et d'atteindre de faibles limites de détection. Perturbateurs endocriniens (PE) sont particulièrement préoccupantes en raison de leur action sur les organismes vivants, même si les niveaux actuels à de très faibles dans l'environnement. L'hormone naturelle 17β-estradiol est présent sur la pollution de l'eau de l'UE Watch List et sujettes à être ajouté à la liste des substances prioritaires réglementés en vertu de la directive-cadre européenne sur l'eau. Extraction en phase solide (SPE) est couramment appliquée pour l'analyse des petits polluants dans l'eau, à la fois chimique 1-5 (chromatographie, spectrométrie de masse) et immunologiques 6-9 méthodes de détection. Ce dernier a gagné un intérêt dans le domaine de la surveillance de l'environnement, comme les immunoessais sont disponibles en grande variété de formats, sont spécifiques à la TArget analyte, et d'atteindre de faibles limites de détection. 6, 7, 10, 11 divers liés à une enzyme dosages immuno (ELISA) sont commercialement disponibles et permettent d'analyser plusieurs échantillons à la fois sur une plaque multi-puits. La procédure consiste dans les étapes de réaction successives qui peuvent prendre quelques heures. Le produit final de réaction peut être détecté optiquement pour déterminer la concentration de la molécule cible sur la base d'une courbe d'étalonnage.
SPE procédures classiques comprennent sorbant pré-conditionné, l'extraction de l'échantillon, le lavage, élution et concentration par évaporation de l'éluant. Le solvant utilisé pour la dilution de cet extrait est choisie en fonction de la méthode de détection. Pour les méthodes immunologiques, la quantité d'influences de solvants organiques fortement la sensibilité de la méthode. 12
En plus de la récupération et les performances de pré-concentration, la méthode doit également être simple et rentable. Automatisation de la procedure contribue à réduire les erreurs humaines liées. Dans nos travaux précédents 13 nous avons présenté notre prototype pour SPE automatisée, et de notre méthode a été appliquée à l'analyse de l'hormone naturelle 17β-estradiol dans des échantillons d'eau de mer. Avec la présente vidéo, nous tenons à souligner les avantages techniques de notre méthode par rapport à hors ligne traditionnelle et en ligne SPE, et notamment sa compatibilité avec détection par immuno-réactions. Nous décrivons le protocole appliqué à des échantillons d'eau pour la détection de 17β-estradiol. SPE est réalisée avec octadécyl-silice (C18) et phase de sorbant élution est réalisée avec du methanol dilué.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un nouveau procédé pour la préparation d'échantillons d'eau suivie d'une analyse immunologique utilisant a été proposé. L'instrument permet d'effectuer extraction en phase solide de manière automatisée et conviviale.
La filtration de l'échantillon d'eau avant son injection dans le système est critique. Toutes les particules encore présentes dans la solution seraient potentiellement provoquer l'obstruction du réseau fluidique et obstruer la colonne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.
Materials
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 – 3000 ng/L |
References
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